美希索中克隆培养

实验方法原理 将细胞悬浮在含美希索的培养基中，将这种细胞种于铺有琼脂（或琼脂糖）凝胶底层的培养皿中。

实验材料 Noble琼脂Difco胎牛血清1.6%美希索

仪器、耗材 两倍浓度培养基生长培养基无菌超纯水无菌锥形瓶吸管通用容器培养皿水浴三角瓶托盘电子细胞计数仪本生煤气喷灯

实验步骤

1. 按照 14.4 实验中步骤 1~7 制备琼脂凝胶底层。

2. 用等体积 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清）稀释美希索（1.6 %美希索，4 Pa-S(4000cps)，以 UPW 溶解，置于冰上）至 0.8 % ，充分混匀，冰上保存。

3. 胰蛋白酶消化单层贴壁细胞，收集悬浮细胞或骨髓细胞，计数。

4. 制备以下稀释浓度的细胞，细胞的最高浓度为 1×105 /ml 。

(a)1×105 /ml

(b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml

(c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml

(d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml

美希索有黏性，用不带针头的注射器更容易操作。

5. 将四种稀释度分別标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 稀释液，分別放人相应容器内，再向每个容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培养基，用漩涡混旋器充分混匀，如果细胞特别脆弱，用注射器（用于分装美希索。由于黏稠，美希索会附着于吸管内壁，造成分装量不准确）上下轻柔地抽吸溶液几次，然后用注射器再从每个容器中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：

(a) 1×105 /ml/皿

(b) 330 /ml/皿

(c) 110 /ml/皿

(d) 37 /ml/皿

6. 将培养皿放置在加湿的温箱屮培养至集落形成。由于集落会在琼脂与美希索的界面形成，所以培养 1 周后添加新鲜培养基 1ml/皿或孔，2 周后在不影响集落的情况下，弃旧液，更换更多新鲜培养基。