聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收（压碎与浸泡法）

DNA 标准参照物 DNA 样品

丙烯酰胺凝胶洗脱缓冲液 氯仿 乙醇 凝胶载样缓冲液 酚 氯仿 乙酸钠 TE

聚丙烯酰胺凝胶 一次性使用的塑料层析柱 转轮或旋转平台 紫外灯

一、材料

1. 缓冲液和溶液

丙烯酰胺凝胶洗脱缓冲液（0.5 mol/L 乙酸镁，10 mmol/L 四水乙酸镁，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.1%（m/V）SDS（可选或不选））

氯仿

乙醇

6X 凝胶载样缓冲液

酚：氯仿（1:1, V/V）

乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)

TE (pH 8.0)

2. 凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶和高分辨率琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 标准参照物，由限制酶消化已知量的 DNA 样品得到

DNA 样品

4. 专用设备

一次性使用的塑料层析柱（如 Quik-Sep 柱，Isolabs，Inc.) 或装有 Whatman GF/C 滤纸致密硅化玻璃棉的注射器针筒

转轮或旋转平台，置于 37℃ 温箱中

手提式长波（302 nm) 紫外灯

二、方法

1. 按照方案 “中性聚丙烯酰胺凝胶电泳” 的方法，进行 DNA 样品和标准参照物的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用放射自显影或长波紫外灯（302 nm) 检测溴化乙錠或 SYBR Gold 染色的凝胶, 以确定目的 DNA 的位置。

2. 用干净、锋利的解剖刀或剃须刀片切下含有目的条带的凝胶，要使切下的聚丙烯酰胺凝胶条尽可能小。可按如下方法中的任何一个操作：

(1) 在紫外灯照射下，将凝胶与 Saran Wrap 膜一同切下，然后从膜上剥下凝胶条。

(2) 紫外灯从下面照射凝胶，用永不褪色的标记笔（如 Sharpie 笔）在玻璃板的背面勾勒出 DNA 条带的位置。翻转凝胶，揭去 Saran Wrap 膜，按照标记笔作的标记切下 DNA 条带。

(3) 当用放射自显影检测时，将曝光后的放射自显影胶片放在 Saran Wrap 膜上，并与凝胶比齐。用标记笔在玻璃板的背面勾勒出所需 DNA 片段的位置。移去胶片和 Saran Wrap 膜，切下该条带。

3. 将切下的凝胶条移入微量离心管或聚丙烯管中，用一次性吸头或接种针对着管壁将凝胶挤碎。

或者，用干净的解剖刀或剃须刀先将凝胶切成小条再放入洗脱管中。

4. 估计出凝胶条的大致体积，向微量离心管中加入 1~2 倍体积的丙烯酰胺凝胶洗脱缓冲液。

5. 盖上离心管盖，在转轮或旋转平台上 37℃ 温育。

6. 样品在台式离心机中以最大转速于 4℃ 离心 1 min。将上清移入另一新的离心管中，应特别小心，不要将聚丙烯酰胺凝胶块转移进去（使用一根拉长的巴斯德吸管效果甚佳)。

7. 向聚丙烯酸胺沉淀物中再加入 0.5 倍体积丙烯酰胺凝胶洗脱缓冲液。混旋片刻，再次离心。合并两次上清液。

8. (可做可不做）上清液通过一次性使用的塑料层析柱（如Isolabs, Inc., Quick-Sep 柱）或装有 Whatman GF/C 滤膜或充填硅化玻璃棉的注射器针筒，以去除残留的聚丙烯酰胺胶块。

9. 将 2 倍体积 4℃ 的乙醇加到穿过液中，冰上放置 30 min。在台式离心机中以最大转速于 4℃ 离心 10 min，回收 DNA。

10. 用 200 μl TE ( pH 8.0) 溶解 DNA, 再加入 25 μl 3 mol/L 乙酸钠溶液（pH 5.2), 然后按步骤 9 的方法用 2 倍体积的乙醇再次沉淀 DNA。

11. 用 70% 乙醇小心洗涤 DNA 沉淀。TE ( pH 8.0 ) 重溶 DNA 至终体积 10 μl。

12. 通过聚丙烯酰胺或高分辨率琼脂糖凝胶电泳对 DNA 进行定性和定量。

(1) 将少量最终制备得到的 DNA 片段（约 20 ng）与 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。

(2) 在适当浓度的聚丙烯酰胺或高分辨率琼脂糖凝胶上样并电泳，用已知的内切酶消化产物作为分子质量标记。分离的片段应和分子质量标记中相同大小的片段同步迁移。

(3) 仔细检査凝胶是否存在 DNA 污染的弱荧光条带。常常可以比较目的条带和分子质量标记条带的相对荧光强度估计 DNA 量。