背根神经节细胞的原代培养实验

原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

孵化8-12d的鸡胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠

含10%胎牛血清的DMEM培养基 神经元维持培养基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10µM阿糖胞苷(ARA-C)

培养瓶

获得消毒动物后详细的步骤如下：

1．无菌条件下仰卧放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，断头后打开胸腹腔，除去内脏器官。从颈部椎管开口插入显微剪，沿脊柱背侧中线两侧剪开椎管，去除暴露脊髓后，即在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节，用精细显微摄小心提取，并剥除其被膜。

2.若施行组织块培养，可用精细显微剪将每个背根节剖为2-3个植块，直接接种于涂有鼠尾胶的基质上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

3.如若需要背根神经节分散细胞培养，则可将分离好的DRG组织块收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清终止消化后，900r/min离心5min,去除上清。而后依照总论的方法在含10%胎牛血清的DMEM培养液中制成单细胞悬液，调整细胞浓度为(0.5-1)X10⁵/ml接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上，37℃,5%CO₂的孵育箱内培养。

4.以上两种培养方法24h后均倾去培养皿内种植培养液，改用无血清培养液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培养。接种第3天，加入细胞分裂抑制剂ARA-C以抑制非神经细胞的增殖，作用48h后半量更换新鲜培养液，以后每周1/2量换液2次。

5.纯化培养的DRGs可以存活2个月之久，纯度可达96%以上。分散培养的DRG神经元48h可见胞体有光晕感，圆形或椭圆形，大小不一，有多极、双极和假单极神经元。2d后给予抑制剂处理后，DRG突起生长迅速，形成稀疏网络状结构。随着培养时间的延长，神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗，神经突起网络变得更加致密，杂质细胞已经脱壁漂浮，培养物背景变得干净清晰很多，免疫细胞化学进一步鉴定培养细胞为神经丝(NF)阳性（图1-3)。

1.组织块培养中，由千背根节被膜的剔除较为困难，将每个背根节剖为2-3个植块则更有利于细胞从植块中爬出，明显提高植块的存活率。

2.获取组织的消化培养时间要视动物年龄做相应的调整，即胚胎期可以控制在20-30min,而仔鼠可以在30-50min内。

3.随着无血清培养基的推广，最新文献报道也将其运用千DRG的培养。但有所不同的是无血清培养基可以直接用于接种海马、皮层等中枢神经元，而DRG则需含血清培养基先接种培养24h后，再换无血清培养基以维持培养，这一点至关重要，否则DRG不能成活。

4.细胞纯化培养时，注意把握ARA-C加入的时间点。若细胞密度较高，无血清培养1d后即可加入，而出细胞密度较低时则需2d后再加入。另外逐步1/2量换去含ARA-C的无血清培养液是保证DRG神经元高纯度的关键步骤。

1.解剖方法上，在DRG分离过程中，腹侧解剖暴露脊髓至关重要。笔者尝试从背侧解剖路径取材不容易获得完整的DRG组织，从而影响细胞的获得率。

2.笔者选用鼠尾胶原作为培养基质，发现神经元胞体及轴突的贴壁能力更强更稳定，适于长期观察；而生长在多聚赖氨酸基质层上的神经元只能在短期内贴壁稳定，随着培养时间的延长，神经元的突起则会漂浮起来，失去基质的支持。特别是经过纯化后的DRG在短期内就会连同整个神经网络脱壁。

3.小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与大鼠相似，但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。鸡胚背根节神经元以假单极为多见，神经突起分枝较少。

4.植块培养时，应先加少撮培养液覆盖每个植块即可，否则植块会被液体浮起，失去基质的支持而无法生长。

来源：《神经生物学实用实验技术》第四军医大学出版社