胎牛血清培养血管平滑肌细胞常用的方法

胎牛血清培养血管平滑肌细胞常用的方法有贴块法(explant)和酶解离法(enzyme disperse)。下面一起来看下这两种方法。

1、贴块法

方法：动物经颈动脉放血后，在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，然后纵行切开血管，刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层，切成约1mm宽的小条，浸泡在含血清的Hank's液中，并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37℃恒温箱，2h左右，取出培养瓶加入20% HyClone胎牛血清的培养液，再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。

不同动物血管结构有差异，猪和猴较易操作，但小动物如兔、鼠因其血管小，血管壁薄等特点，使之难以分离。另外组织块太薄，不易粘附培养基，也使细胞较难生长。为了保证培养的成功，应注意：

①种植组织块的数目，如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30;

②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清，一般可加入牛血清，若小牛血清增殖效果差，应加胎牛血清(FBS)，通常浓度为10%～20%;

③培养基的选择：常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium)，M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。

2、酶解离法

沿动脉纵轴切开后，刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3，注意不要混入内皮细胞，将组织块切成1-2mm2，放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中，37℃，0.5～1.5h。离心去上清，重复上述消化步骤，然后再离心(9000r,4min)，收集细胞，在5%～10%同种血清或HyClone胎牛血清的M199培养基中调整细胞数，然后转入30～90mm培养皿中培养，对于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺(0.2g/L)较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。

综上所述，贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高，量多，操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失，亚细胞器增加。相反，酶解离法，由于酶的作用使细胞间失去连接，细胞内肌丝含量丰富，保持收缩型状态。培养平滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。由于贴块法和解离法处理方式不同，在细胞培养的zui初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长，培养环境趋于一致，细胞特性上也趋于近似。