胚胎干细胞培养标准操作规程(SOP)

一、细胞

多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡

1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。
　　2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
　　3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。
　　4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
　　5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。

二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到 80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液

DMEM(高糖) 
　　马血清（HS） 
　　L-谷氨酰胺（200mM） 
　　MEM NEAA（10mM） 
　　HEPES（1M） 
　　β-巯基乙醇（55Mm） 
　　PEST 
　　ESGRO

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤

1．从液氮中取出一管细胞；
　　2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
　　3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
　　4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
　　5．离心3分钟；
　　6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
　　7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
　　8．孵育。