胰蛋白酶切蛋白质样品的制备
双向薄层电泳与层析分离多肽片段
反向高效液相层析绘制多肽图谱
| 实验材料 | 蛋白质 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 甲醇 电泳缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 凝胶电泳 |
| 实验步骤 | 1. 用单向或者双向凝胶电泳将 32P 标记的目的蛋白质与其他不需要的成分分开。 2. 电泳结束后，用 50% 甲醇清洗三次，时间控制在 6 小时，去处 SDS 和电泳缓冲液将凝胶放在两张塞热玢膜（Bio-Rad) 之间吸干。用放射性墨水在凝胶边缘点几个记号。 3. 置于 X 射线片下曝光，在读片灯下看放射自显影图，找到放射标记的目的蛋白带用干净刀片小心地切下目的胶带，放入带螺帽的离心管用 0.5~1 ml 50 mol/L 碳酸氢铵泡。剥下赛璐玢膜，将胶带修剪成更小的小条。 4. 加一等份胰蛋白酶（1 μg 溶于 50 mmol/L 碳酸氢铵，TPCK 处理过），于 37℃ 在 360° 旋转器中消化和洗脱几小时或者过夜。 5. 10000 g 离心样品 5 分钟。小心取出上清，用一小等份做液闪计数估计回收效率。 6. 用真空离心浓缩器（Savant) 抽干上清。在 50 μl 碳酸氢铵中，用 0.5 μg 胰蛋白酶于 37℃ 继续消化 4 小时。离心抽干样品，用 20 μl pH 1.9 的电泳缓冲液重悬，以去处残余的碳酸氢铵。再次离心抽干样品。此时样品已可进行电泳。 |
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