胶体金免疫层析法在乙型肝炎病毒表面抗原检测上的应用

实验概要

本实验用胶体金免疫层析法检测了乙型肝炎病毒表面抗原。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBs)，制成免疫层析检测试条。血清中HBsAg与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动，与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。

实验原理

免疫层析技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素   (HCG)的测定，后来由胶体金代替胶体硒用于乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)等检测。我们用胶体金标记单克隆乙肝病毒表面抗体(抗   HBs)，制成检测HBsAg的胶体金免疫层析法(GICA)检测试条。用该法检测HBsAg，其灵敏度与酶免疫法(EIA)相近，并具有简便快速、特异性好、不需要仪器设备等优点。

主要试剂

1. 氯金酸(HAuCl·Cl₃·4H₂O)

2. 抗HBs：单克隆抗HBs及羊抗HBs均为本实验室制备

3. HBsAg灵敏度标准参比品

4. HBsAg酶免疫诊断试剂盒

5. 血清标本：315份肝炎患者血清采自住院患者。其中乙型肝炎患者血清220份，甲型肝炎、戊型肝炎患者血清各30份，丙型肝炎患者血清35 份。

实验步骤

1. 胶体金-抗HBs结合物的制备：

超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01%。煮沸后每100 ml加入 1%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml，继续煮沸15分钟。待冷却后用0.2 mol/L K₂CO₃调至pH  8.2.快速搅拌下加入纯化的抗 HBs igG 2 mg，并继续搅拌15分钟。加入牛血清白蛋白240 mg，再搅拌5分钟，最后加入10%  naCl水溶液使含NaCl浓度为1%，混匀。以2 000 r/min离心10分钟，弃沉淀，上清液以10000  r/min离心60分钟。小心吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的金-抗HBs 结合物。溶于贮存液中(0.02 mol/L，pH 7.4  Tris-HCl，含40 mg/100 ml分子量20 000的聚乙二醇，50%甘油，0.02% NaN3)，-20℃保存。

2. 免疫层析测试条的制备

测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分点金-抗HBs结合物；硝酸纤维素膜上用  0.02 mol/L，pH7.4 PBS稀释成100μg/ml的羊抗HBs(检测线)和羊抗鼠IgG(对照线)包被成两条约1  mm宽的线条，晾干后用含10%新生牛血清的PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片(支持物)上，切成0.8 cm×8 cm的条，加干燥剂密封保存。

3. HBsAg检测

以新鲜血清为好。试管中加入0.1～0.2  ml血清，将测试条点有金标记抗体端插入血清内即可。结果判定：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为HBsAg阳性；仅出现一条红色线(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。如果无红色线条出现则视为试剂失效。结果确定时间：强阳性标本在  2分钟内即可在检测线见到红色胶体金颗粒聚集；弱阳性标本(1～2 ng/ml)约需要20分钟确定结果。