胶体金制备注意事项及应用

一、胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存

胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。

金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。

当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4～10℃ 贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。

二、制备高质量胶体金的注意事项

（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。

（2）试剂、水质和环境：剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。其１％水溶液在４℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少，否则实验的结果将缺乏重复性。

金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞，故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变，应选用缓冲容量足够大的缓冲系统，一般采用柠檬酸磷酸盐(pH3～5.8)、Tris-HCL (pH5.8～8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5～10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。

（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。

（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。

三、胶体金技术的应用

1、免疫学中的应用

（1）胶体金在电镜水平的应用

胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为 3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。

胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：

① 细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。

② 单层培养中细胞内抗原的检测。
③ 组织抗原的检测。

金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。

实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。

（2）胶体金在光镜水平的应用

胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：

① 用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。

② 检测培养的单层细胞胞内抗原，

③ 组织中或亚薄切片中抗原的检测。

胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。

（3）胶体金在流式细胞仪中的应用：

应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。

（4）凝集试验：单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。

（5）免疫印迹技术(immunoblotting)：免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、ＲＩＡ）进行定量。

免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。

利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。

由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。

（6）胶体金在肉眼水平的应用

胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：

①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul；

②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用；

③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；

④实验结果可以长期保存；

⑤时间大大缩短，提高了检测速度。

金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。

2、免疫诊断技术中的应用

胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。