脂染介导的DNA转染实验

指数生长的哺乳动物细胞培养物

脂染试剂 NaCl 枸橼酸钠 质粒 DNA 纯化闭环质粒 DNA 细胞生长培养基

试管 聚苯乙烯或聚丙烯试管 组织培养皿

材料

缓冲液与溶液
贮存溶液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。将贮存液稀释成适当浓度。

脂染试剂


NaCl(5mol/L)(选用）
用于稀释 DOGA。

枸橼酸钠（pH5.5,20 mmol/L) 含 150 mmol/LNaCl(选用）
DOGS 用作脂染试剂时，可用于代替灭菌水稀释质粒 DNA（Kichler et al.1998)。

核酸与寡核苷酸

质粒 DNA
如果是第一次用脂染或使用不熟悉的细胞系，应使用编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶或者绿色荧光蛋白的表达质粒（见第 17 章信息栏中的绿色荧光蛋白）。这些质粒可从几个生产商处购买（如，pCMV-SPORT-β-gal,Life Technologies 公司，pEGFP-F,CLOTECH 公司；见图 16-2,16-3)。

纯化闭环质粒 DNA 可用层析柱或按照第 1 章介绍的溴化乙锭-CsCl 梯度离心。
DNA 用水溶至 1ug/ul。



培养基

细胞生长培养基 [完全培养基，无血清培养基与（备选的）选择性培养基]

特殊设备

试管，聚苯乙烯或聚丙烯试管
DGTMA 会与聚丙烯发生非特异性结合，必须使用聚苯乙烯试管。

组织培养皿（60 mm)
本方法是按照使用 60 mm 细胞培养皿设计的，如果使用多孔平板、细胞瓶、或者不同直径的平皿，则应按比例改变细胞密度与试刑用量。见表 16-3。

附加试剂

本方法步骤 9 可能需要第 17 章方案 7 所列试剂。

细胞与组织

指数生长的哺乳动物细胞培养物






方法

1. 脂染前 24 h, 通过胰酶消化收集细胞，以 10⁵ 细胞/平皿的密度平铺细胞于 60 mm 组织培养皿上（或 5X10⁴ 细胞/35 mm 平皿)。加 5 ml 生长培养基（用 35 mm 平皿则加 3 ml)，于含 5%~7%CO₂ 的 37°C 温箱孵育 20~24 h。
转染时细胞应 75% 长满。如果转染前细胞生长不足 12 h, 细胞就不能很好地吸附在培养皿上，与脂类接触时易于脱落。

2. 用 100ul 灭菌去离子水（使用 Lipofectin 时）或含 150 mmol/LNaCl 的 20 mmol/L 枸橼酸钠（pH5.5)(使用 Transfectam 时）于聚苯乙烯或聚丙烯试管内稀释 1~10ug 质粒 DNA。在另一个试管内用灭菌去离子水或 300 mmol/LNaCl 将 2~50ul 脂溶液稀释至 100ul。
重要事项：用 Lipofectin 转染时，由于阳离子脂类 DOTMA 会与聚丙烯发生非待异性结合，故使用聚苯乙烯试管，不要用聚丙烯试管。至于其他阳离子脂类，根据生产商的推荐选择试管。

3. 室温下孵育 10 min。

4. 将脂溶液加入 DNA 中，用吸管吹打几次混匀，室溫下孵育 10 min。

5. 孵育 DNA-脂溶液时，用无血清培养基将要转染的细胞洗涤 3 次，然后于每一 60 mm 平皿中加入 0.5 ml 无血清培养基，将细胞再放入含 5%~7%CO₂ 的 37°C 温箱中孵育。
在加 DNA-脂溶液前，用无血淸培养基洗涤要转染的细胞非常重要有时候，血清会强力抑制转染（Felgner and Holm 1989)，同样，胞外基质复合物，如硫酸蛋白聚糖也会抑制转染，可能是通过结合 DNA-脂类而阻止受体细胞质膜与其发生相互作用。

6.DNA-脂溶液孵育 10min 后，于每一管内加入 900ul 无血清培养基。用吸管吹打几次混匀，室温下孵育 10 min。

7. 转移各管 DNA-脂溶液至 60 mm 平皿的细胞中，于含 5%~7%CO₂ 的 37°C 温箱中孵育 1~24 h。

8. 细胞在 DNA 中孵育适当时间后，用无血清培养基洗涤 3 次，加入完全培养基解育。

9. 如果是稳定转染细胞，继续进行步骤 10。脂染 24~96 h 后用下述方法之一检査细胞。

• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照第 17 章方案 7 所述步骤检测细胞裂解液中酶的活性，或者依照附加方案：单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶所述通过组化染色检测。

• 如果使用表达绿色荧光蛋白的质粒 DNA, 在 450~490nm 光下用显微镜检査细胞。

• 如果使用其他基因产物为标志，可以通过体内代谢标志进行放射免疫、免疫印溃、免疫沉淀，或者分析细胞提取物中酶活性等方法分析新合成的蛋白。
为减小不同培养血之间转染效率的差异，最好 （1）. 用每一构建体转染数个培养皿；（2）. 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）. 将细胞汇集起来；以及 （4）. 重铺细胞于几个培养皿上。

10. 分离稳定转染体：细胞在完全培养基中孵育 48~72 h 后，用胰酶消化细胞并用合适的选择培养基重铺细胞。每 2~4 天更换培养基，持续培养 2~3 周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。这样，独立克隆便可以克隆、繁殖，以用于检测 (方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《细胞实验手册》的第 86 章])。
用预冷的甲醇固定细胞 l5 min. 然后室温下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以纪录细胞克隆数目。Giemsa 染液应是使用前用磷酸盐缓冲液或水新制备的，用 Whatman1 号滤纸过滤。