脂筏的分离和应用（三）

辅 助 方 案 4 DEAE 葡聚糖凝胶的制备

材料

D E A E 葡聚糖凝胶 A -25

lmol/L N a O H

0.5 m o l / L 乙酸：将 57. 5m l 的冰乙酸稀释于2 L 水中

甲醇

溶 剂 A : 30 : 60 : 8 (V /V /V ) 氯仿/甲醇/水

4L 侧臂烧瓶

带滤 纸 的 布 氏 漏 斗（直 径 18. 5c m )

250m l 试 剂 瓶（带磨口玻璃塞或带 Teflon 内衬螺旋瓶盖）

辅 助 方 案 5 C1 8 反相色谱柱的制备

材 料

C 1 8 反 相 颗 粒 桂（Millipore)

I : 2 ( V A O 氯仿/ 甲醇

甲醇

玻璃棉

5 ml —次性玻璃移液管

125m l 的带单孔塞的侧臂烧瓶

I m l 的一次性玻璃瓶

1 . 在 一 个 5m l — 次 性 玻 璃 移 液 管 中 填 入 少 量 的 玻 璃 棉 。倒 入 反 相 C 1 8 颗粒硅形成1.5m l 的柱床。再在上面放置一小片玻璃棉。

2 . 将移液管置于 125m l 侧臂烧瓶的带单孔塞上，连接上真空吸引器。用 35m l 的 1 : 2(V A O 氯仿/ 甲醇洗涤，接 着 用 5m l 甲醇洗涤，最 后 用 10〜20m l 的水洗涤，均在真空下进行。

3 . 每次使用前，重复上述洗涤步骤以去除游离的 C 18。注意洗涤时不能在加水后直接加入含氯仿的有机溶剂。干燥状态下可保存至一年，并可反复使用达 1 0 次。

辅 助 方 案 6 用甲基-P-环式糊精去除胆固醇来破坏脂筏

附 加 材 料

P B S

预热的无血清培养基，含 或 不 含 10m m 〇 l/L 甲基-P-环 式 糊 精（M B C D ， Sigma) 和lmg/ml B S A

缓 冲 盐 溶 液（BSS，见附录 1)，含及不含 10 mmol/L 甲基-卩-环式糊精和 l m g /mlBSA

对于贴壁细胞

l a . 铺 细 胞 于 I O c m 培养皿 中 ，待 汇 合 生 长 到 7 0 % 〜 9 0 % 时 ，用 P B S 洗 两 遍 。加入2.5m l 预热的含 10m m 〇 l/L 甲基卡环式糊精和 lmg/ml B S A 的无血清培养基。

细 胞 的 长 满 程 度 对 胆 固 醇 的 去 除 效 果 有 很 大 影 响 ，应 在 不 同 批 次 的 实 验 中 严 格控 制 保 持 一 致 。

2 a . 置 37°C 孵 育 15〜60 min (根据辅助方案 7 来优化孵育时间）。移去培养基，用无血清培养基洗 2 次。加 入 I O m l 的无血清培养基后即可以进行所需的细胞功能测定。

孵 育 期 间 培 养 皿 的 振 荡 会 强 烈 影 响 胆 固 醇 的 去 除 效 果 ，应 在 不 同 批 次 的 实 验 中严 格 控 制 保 持 一 致 。

对于非贴壁细胞

Ib. 用 B S S 洗 细 胞 2 遍 。用 含 10m m o l /L 甲基-(3-环式糊 精 和 lmg/ml B S A 的 B S S 将细胞 重 悬 至 2 X1 0 6〜 4 X 106 个细胞/ml。加入 2.5ml 预热的含 1 〇 mol/L^甲基-β-环式糊 精 和 I mg/m l B S A 的无血清培养基。置 37°C 孵 育 15〜60 min (根据辅助方案 7 来优化孵育时间）。

2b. 室温， 225 g 离 心 5〜lOmin。用 B S S 洗 2 遍 。加 入 I O m l 的无血清培养基后即可以进行所需的细胞功能测定。

辅 助 方 案 7 甲基-P-环 式 糊 精（MBCD) 处理去除胆固醇的动力学测定

材 料

60〜lOOCi/mmol [1，2,6,7-3 H (N ) ] 胆 固 醇（[3 H ] 胆固醇)

含血清的培养基

细胞

PBS

含 1 % (m /V ) B S A 的无血清培养基

B S S ，可选

含 10 mmol/L M B C D (Sigma) 的无血清培养基

含 1 0 % ( V A O Triton X -100 的 PBS

60m m 组织培养皿

液闪仪

1 . 在无菌条件下加入 l〜2MCi/m l [3 H ] 胆固醇到含血清的培养基中，使溶剂浓度保持在 0 . 1 % 。置 37°C 培 养 12〜24 h 使胆固醇与血清脂蛋白达到平衡。准 备 5 个 60m m培养皿的贴壁细胞，预计在 2d 后达到汇合生长至 7 0 % 〜9 0 % ，或者非贴壁细胞，预

计 在 2 d 后 达 到 I O X l O 6 个细胞量。

2 . 加入正常培养体积的含 [3 H ] 胆固醇的培养基，培 养 2d 后 ，去 除培养基，用 PBS洗 2 次。

3 . 将细胞转移到新的 60m m 培养皿中以避免结合在塑料皿上的 [3 H ] 胆固醇干扰试验结果。对于贴壁细胞，胰酶消化后，用含血清培养基重悬铺于新培养皿中以促进贴壁 。待贴壁后，用 PBS 洗 2 次 ，换 成 含 1 % B S A 的无血清的培养基。对于非贴壁细胞 ，重悬于含 1 % B S A 的无血清的培养基中。 37°C 培养过夜。

4 . 取 2 X 106 悬浮细胞或一个汇合生长至 7 0 % 〜9 0 % 培养皿的贴壁细胞，用 P B S 或 BSS洗 2 次 ，换 入 I m l 的 含 10 mmol/L M B C D 的 无 血 清 培 养 基（可 以 含 lmg/ml B S A )。对照组换入不含 M B C D 的同样培养基。 37°C 孵 育 10 min、 20 min、 30m i n 或 60 min。

5 . 移去并保留培养基（贴壁细胞）或 细 胞 沉 淀（非贴壁细胞），用 P B S 或 B S S 洗一遍。对贴壁不牢的贴壁细胞，将培养基转移至 1.5m l 小离心管中，最高转速离心 5m i n 以沉淀细胞并去除漂浮的细胞或大的细胞碎片。将上清吸到一个新的离心管中。

6 . 在室温下用含 1 0 % (W V ) TritonX-I O O 的 P B S 裂解单层贴壁细胞或离心后的悬浮细 胞 20 min。最高转速离心 lmin，转移上清至一个新的离心管中。

7 . 将留存的澄清培养基用 1 0 % Triton X- 1 0 0 的 PBS 溶 液 调 至 1 % Triton X- 1 0 0 浓度。加 1 / 1 0 体 积 的 PBS 至澄清的细胞裂解物中。用液闪仪计数双份 100W 澄清的细胞裂解物或培养基的放射活性。确定每次试验中培养基的总计数比例。

辅 助 方 案 8 使 用 MBCD-胆固醇复合物进行细胞胆固醇去除

材 料

胆固醇

I : 1 氯仿/甲醇

甲基-P-环 糊 精（M B C D ; Sigma)

无血清的培养基

V PBS 或 BSS

带 Teflon 内衬螺旋盖子的 10〜15m l 玻璃管