脉冲场凝胶中浓缩DNA片段的回收

琼脂糖酶 基因组 DNA

平衡缓冲液 注射 转染缓冲液

NuSieve GTG Agarose minigel 点滴透析的膜 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

平衡缓冲液（1X TBE，100 mmol/L NaCl，30 μmol/L 精胺，70 μmol/L 亚精胺）

溴化乙锭（1 μg/ml) 或适当稀释度的 SYBR Gold

注射/转染缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，0.1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，30 mmol/L 精胺，70 μmol/L 亚精胺）

2. 酶和缓冲液

琼脂糖酶

3. 凝胶

NuSieve GTG Agarose minigel (5%)

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 分子质量标准

低熔点琼脂糖栓包埋的基因组 DNA

5. 专用设备

点滴透析的膜（孔径 0.05 μm)

设置 65~68℃ 及琼脂糖酶消化的适宜温度的水浴

二、方法

1. 准备制备低熔点琼脂糖 PFGE, 它将提供分离目的 DNA 片段的最佳分辨率。

2. 制备槽的两侧加样孔分别加入 DNA 分子质量标准和单个酶切基因组 DNA 的凝胶栓。 将制备样品加入制备槽。

3. 电泳结束后，切下含有分子质量标准和单个基因组 DNA 栓的泳道，室温溴化乙锭或 SYBR Gold 染色 30 min。如果需要可以水中脱色 30 min。不要染制备泳道。

4. 紫外照射检査染色切片，在切片目的 DNA 的侧面做上刻痕标记。

5. 普通照明下，重新把染过色的分子质量标准和单个栓的凝胶组合起来，将未染色的制备泳道中的目的 DNA 大致定位。仔细地用干净剃刀割下这个区域，把凝胶切片转移到带盖聚丙烯管中。

6. 室温下用 40 ml 平衡缓冲液平衡含有分离 DNA 分子的凝胶切片 20~30 min。其间始终轻轻振动混合物。

7. 倒去缓冲液，65~68℃ 熔化凝胶。熔化时旋转小管以确保熔化完全。记录下熔化凝胶切片的体积。

8. 5% NuSieve GTG 微型胶仍在胶带围成的模具上时，在凝胶的顶层切去足够的体积以容纳熔化的含有 DNA 的凝胶切片。

9. 将熔化的凝胶切片倒入其中，凝固。60V 恒定电压，以毎毫米低熔点凝胶电泳 12 min, 将分离的 DNA 泳入 5% 的凝胶中而浓缩。

10. 电泳结束后，由胶的中心切下薄薄的一片，溴化乙锭染色。确定 DNA 迁移入胶的长度（通常约 2 mm)。

11. 除去凝胶中的低熔点部分，将含有浓缩 DNA 的 5% 凝胶切割的尽量小。

12. 在含有 100 mmol/L NaCl、30 μmol/L 精胺、70 μlmol/L 亚精胺的 12 ml 1x 琼脂糖酶酶切缓冲液中平衡凝胶切片。室温下轻轻振动温育 20 min。

13. 倒出缓冲液，将凝胶切片转入微离心管，65~68℃ 熔化。将熔化的凝胶转入水浴，水浴温度设置在琼脂糖酶作用的适宜温度（商家推荐)。

14. 温育熔化的凝胶 15 min, 按 5% 凝胶的初始体积加入适量的琼脂糖酶消化。

15. 消化后，台式离心机以最大转速离心 5 min 沉淀碎片，将上清转入新的离心管。

16. 用 0.05 μm 孔径的点滴透析膜透析所得上清。

(1) 将上清点在膜的中心，光面向上浮于 100 ml 注射/转染缓冲液。

(2) 室温下透析 1 h。换掉原缓冲液，重新加入 100 ml 注射/转染缓冲液再透析 1 h。

(3) 将 DNA 转入新的微量离心管。