脾脏组织单细胞悬液的制备方法

1. 剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量F液及20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入5mlF液及20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用100目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀1500转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗3次，每次以500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以200目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-1×109个/ml的单细胞悬液备用。

2. 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70ml组织研磨器内，加入2mlF液及20%胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用5mlF液及20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经200目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀800rpm×2min ，再用细胞洗涤液洗3次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-1×109个/ml的单细胞悬液备用。

3. 酶消化法：    

A．用F液将胶原酶稀释，终浓度为400 U/ml，至于冰浴备用。

B．取一适当大小培养皿进行操作：用镊子夹碎动物脾脏，加入稀释后的胶原酶，37℃消化20分钟。

C．以100或200目不锈钢滤网（另购）过滤，离心沉淀800prm×2min ，再用细胞洗涤液洗3次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为2×108-1×109个/ml的单细胞悬液备用。

细胞计数方法:    

细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。

计数与计算过程

1）在细胞计数板*放置计数的盖玻片。

2）用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。

3）置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4）按下式计数细胞悬液的密度： 细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/ml×稀释倍数

公式中乘以104 因为计数板中每一个大格的体积为：

 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

细胞计数要点： 

A．进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200个/10mm2或>500个/10 mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。

B．要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

C．取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

D．数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。

E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。