自动定氮仪测定稻米中蛋白质

　　蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，细胞和生物体在完成由基因编码的生命活动过程中需要许多不同的蛋白质协同作用，蛋白质是细胞做功的工具，与生命的起源和进化都密切相关。所以食品中蛋白质的多少，不仅表示食品的质量，也关系着人体健康。食品中蛋白质含量高低是评价食物营养成份的主要指标之一。稻米是人类重要的粮食作物，稻米蛋白质因其较为合理的蛋白及氨基酸组成而表现出优良的营养品质，蛋白质含量不仅影响其营养品质，而且也对蒸煮品质有重要影响。在评价稻米品质的相关标准中蛋白质及其含量被认为是评价品质并为深加工行业生产提供工艺参数的重要指标之一。

　　目前测定蛋白质含量的方法有很多种，常见的有凯氏定氮法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝法和质谱法等。有报道紫外吸收法无法测出牛奶、酸奶的蛋白含量，测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差较大，不具实际使用价值。双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法，准确度好，精密度好，呈色稳定性好，试剂单一，方法简便，但灵敏度不高，约为1mg，故现在已很少使用。考马斯亮蓝染色法快速、灵敏，但只有作微量蛋白测定时的结果才准确，因此在实验前应将样品稀释至蛋白  浓度为0.1-1mg/mL，而且实验必须在1h内完成，不然测试结果不准确。质谱分析法中肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，但是质谱的准确性对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏定氮法适用样品范围广泛、测试结果准确、重现性好，但是传统的凯氏定氮法多利用开氏瓶消化和半微量定氮蒸馏器定氮，装置复杂，蒸馏过程较难控制，易发生倒吸现象而致实验失败，并且消化时间长，对环境污染较大，不利于实际使用。本实验中使用定氮消化炉和定氮仪代替前两者，既兼顾凯氏定氮法的准确性，操作又非常方便，节省时间，提高了工作效率，可适合大批量样品测定。本实验测定本地7种稻米中的蛋白质含量，并对测试结果作比较分析，为人们食用稻米提供参考。

　　1实验部分

　　1.1实验材料

　　巢湖市半汤镇粮店购买的丝苗米、汕优米、东北大米、当地粳稻米、糯米以及从庐江县白山镇带回的当地的早稻米和晚稻米共7种样品。

　　1.2主要仪器和试剂

　　SKD-600自动定氮仪（杭州麦哲仪器有限公司），SKD-20S2智能数控消化炉（上海沛欧分析仪器有限公司），电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司），25mL酸式滴定管。

　　混合催化剂：硫酸钾（K2SO4）100g，硫酸铜（CuSO4·5H2O）10g及硒（Se）1g，分别研磨成粉，再混合均匀。浓硫酸[H2SO4，ρ=1.84g/cm3，化学纯]。硫酸标准液[c（1/2H2SO4）=0.02mol/L]：先配制[c（1/2H2SO4）=0.1mol/L]硫酸溶液，标定后稀释5倍。氢氧化钠溶液[c（NaOH）=10mol/L]：400g氢氧化钠放入1L的烧杯中，加入600mL的无CO2蒸馏水溶解，冷却后，用无CO2的蒸馏水配成1L，充分混匀，储于塑料瓶中。混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇[w(CH3CH2OH)=95%]中。硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g/L]：溶解20硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷却后，加入20mL的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c（NaOH）=0.1mol/L]，直至溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L。

　　1.3实验方法

　　称取烘干、磨碎（0.25mm）米粉0.2000g-0.4000g，置于50mL消煮管中，加混合催化剂1.8g，滴加几滴蒸馏水湿润样品，再加入浓硫酸5mL，小心摇匀后盖上小漏斗，置消化炉上消煮至溶液清亮带蓝绿色时，再加热30分钟后关上消化炉冷却。将自动定氮仪上的蒸馏水、氢氧化钠溶液、硼酸指示剂溶液、稀释液、冷却水、集液瓶连接好，打开仪器开关，将盛有消化液的消化管直接上机定氮。结束后用硫酸标准液滴定所得样品。每批样品测定同时按同样操作步骤进行空白实验，以校正试剂误差。同时使用传统的凯氏定氮法测定样品，两者结果进行比较。

　　1.4统计方法

　　每个样品分别做3个平行样，取其均数加减标准差，用SPSS16.0统计软件进行统计分析。

　　2结果与讨论

　　2.1样品的用量

　　称样量的大小取决于样品的含氮量，若含氮1%-5%，称样量为0.2000g-0.4000g，可根据含氮量的水平适当增减称样量。

　　2.2样品消化中注意事项

　　样品加入消化管时注意避免样品黏附在管壁上防止消化不充分；缓慢调节消化炉上升温度，避免温度上升过快使消化管中消化液冲出，造成污染和结果不准确；样品消化澄清后，应继续消化30分钟，使样品消化更完全，结果更为准确。

　　2.3消化定氮装置

　　采用智能数控消化炉代替传统开氏瓶，操作方面，可同时消化多个样品，适合批量测样。自动定氮仪不用人工加酸、加碱等繁琐操作，使用方便，但要注意蒸馏、加酸、加碱、稀释的时间控制和加热功率选择，尽量定氮完全。定氮仪在蒸馏过程中停冷却水，缺液、安全门未关、样品位置未放好、集收液温度超温等意外情况仪器提示或报警，安全高效。

　　2.4测定条件选择

　　SKD-600自动定氮仪采用单片微机控制，大屏幕液晶屏显示，接通电源后按提示操作，简单方便，控制可靠。样品参数设置中，蒸馏时间为00.0-99.0分钟，加酸时间为00.0-30.0秒，稀释时间00.0-30.0秒，加碱时间00.0-30.0秒，蒸馏有四种模式，即功率为50%，60%，80%和100%。以上参数可根据实际情况灵活选择，可自由调整。本次实验中参数选择为：蒸馏时间为07.0分钟，加酸时间为05.0秒，稀释时间05.0秒，加碱时间05.0秒，蒸馏功率为80%。

　　2.5粗蛋白质

　　凯氏定氮法测定的氮中还包含有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，由此计算出的蛋白质称为“粗蛋白质”，如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离后进行全氮测定，由氮换算的蛋白质含量称为“纯蛋白质”。

　　2.6测试结果分析

　　表1可见同一样品的三次测定结果差异很小，表明自动定氮仪法测定结果很准确，重现性非常好。自动定氮仪法与传统凯氏法对同一样品测定结果基本一致（表2）。不同稻米蛋白质含量差异较大（表2），丝苗米、汕优米和当地粳稻稻米蛋白质含量最大，三者之间没有显著差异；晚稻稻米蛋白质含量较前三者低，比东北大米稍高；早稻米和糯米蛋白质含量最低，且两者没有显著性差异。