自动生化分析仪基本参数及应用(2)

 三、样品量、试剂量与稀释量

    有关参数包括样品量、试剂量、稀释水量、最小反应体积和最大比色杯容量等。如HITACHI7170反应体积180~380µl，最大体积570µl。BT224半自动生化仪流动比色池容积33µl，吸液量200～990µl，最适体积500µl。 www.labdd.com

    1．最小反应体积在仪器光度读数要用于结果计算时，反应液液面高度不低于光度计光径的最小体积。它保证仪器的正确读数和计算，也是仪器测定精度和经济性的指针之一。在有的仪器中，它以反应体积的下限表示，有的则专门标明最小反应体积。在单试剂测定中，样品与试剂的总体积不得少于此参数。在双试剂测定中，若R1与样品的反应读数不纳入结果计算。R1自勺加液量可不考虑此参数，如连续监测法；否则应考虑它对结果的影响，如终点法在加R2之前读数，并以此来扣除试剂或样品空白时。

    在半自动生化仪中，最适吸人量相当于最少反应体积。它与进液管道长度、流动比色池容积，吸液泵抽吸力大小和液体黏稠度有关，它要保证光度检测不受空泡和前后样品携带污染的干扰。因此，吸人体积不能任意降低，必要时，应加大反应液量和吸人量。

    2．最大比色杯容量这个参数含义明确。在有的仪器中，它以反应体积的上限表示，有的则专门标明最大比色杯容量。反应液超过此体积，将致液体外溢，仪器测定系统被污损。

    3．样品试剂比例样品与试剂的比例(SV：RV)，也可表示为样品体积分数——样品体积与反应液总体积的比值(SV／TV)，是方法学基本参数。酶活力测定中，样品在总体积中的比例应在10％以下。一般来说，待测物质在样品中含量低的、生理波动范围大的，样品用量较大。如Trinder反应测定血清葡萄糖、胆固醇等，样品试剂比例多为1：1OO，测定血尿酸或高密度脂蛋白胆固醇，常增加为1：50；ALT和AST的样品试剂比例多为1：1O至1：20。方法灵敏、吸光度高的实验方法，样品试剂比例小,如白蛋白BCG法，样品试剂比例常为1：200。肌酐Jaffe氏法监测时间短、吸光度值较低，样品试剂比例多为1：10。一般应以试剂说明为准，不宜轻易改动。 copyright labdd.com

    (1)改动样品试剂比例，影响一系列方法学参数。若比例增大，则线性范围缩小，线性反应时间缩短，样品内源性干扰、基质效应增加、旁路反应会增强，方法特异性也下降。若比例减少，检测信号偏低，信噪比(噪音／信号)增大，当仪器精度不高时，会加大测量误差。

    (2)改动样品试剂比例，对某些反应有影响。如碱性磷酸酶(AI_P)，有文献报道：当样品试剂比例从1：25降至1：50时，酶活力测定值增加，再低于1：50时不再增加。这一效应可能是较高稀释度下AIJP多聚体解聚的结果。体液样品稀释也可能对测定结果产生影响：④大多数蛋白质在浓溶液中的分子构象比稀溶液中稳定，样品稀释可影响酶的稳定性。(2)降低样品中内源性抑制剂或激动剂的浓度，如以蒸馏水稀释血清，可能因降低血清中淀粉酶的激动剂氯离子的浓度，致测定淀粉酶结果偏低；随血清稀释倍数增加，肌酸激酶测定活力增加，可能与降低样品中AMt，、胱氨酸等内源性抑制剂有关。 copyright labdd.com

    (3)双试剂时要兼顾R1、R2和样品三者的比例，尤其不宜改动试剂间的比例。R2要考虑仪器规定的加液最小体积，同一试剂瓶死体积下分液量小而浪费大的经济问题等。?水或可以指定的液体。它的主要用途有两个。一是用于浓缩试剂的稀释，或样品、校准品的稀释。二是在样品加量小的时候用来冲洗样品探针，减小携带误差；但用量不宜太多，以免稀释试剂影响反应。要把稀释水量纳入样品试剂比例和反应液总体积考虑。必要时，干粉试剂复溶也要考虑此因素。

    四、试剂空白(Reagentblank)监测参数

    无样品或以水代替样品在反应过程中观察试剂空白值或其变化情况，主要用于监测试剂质量及仪器稳定性，利用试剂空白对试剂本身或反应漂移引起的误差进行补偿，用以校正△A或△A/min。它与测定波长、光径大小、不同试剂及配方和样品试剂比例等有关，不能盲目套用，必要时宜实际测定。

    1．试剂吸光度上限和下限定点监测试剂的吸光度。它常用规定波长及光径下的吸光度值表示。仪器的试剂空白检测点因仪器和测定方法的不同而有差异。终点法常在PO点读数，连续监测法常以反应监测起始点来判读。仪器在试剂空白检测及相关的校准测定时，若监测到超过此参数的限值，则提示试剂失效或校准无效。反应吸光度向上的试验取上限值：如Trinder反应以酚或2-羟-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用，生成红色色素，试剂有一定的自发氧化，其试剂一般要求试剂吸光度上限≤0.1-0.4。以结合型硝基苯衍生物作为底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反应吸光度向下的试验取下限值：如以NADH或NADPH为辅酶的ALT和Urea(紫外法)等试验，一般要求试剂吸光度下限≥1．0。

    2．试剂空白速率顾名思义，它是在反应过程中对试剂空白的变化速率作连续监测，其数值在样品测定结果中自动扣除。试剂中可能混有的其他杂酶或干扰物对试剂空白速率有影响。在酶促反应中，试剂空白速率也是试剂在监测过程中底物自发降解的结果。底物为还原型辅酶者，本身不稳定而分解，多呈下降趋势；以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在碱性环境中自发水解成被测物质，多呈上升趋势。此参数主要用于连续监测法。一般认为酶活性测定的试剂空白速率(△A/min)应≤0.001~0.003。由于试剂空白速率与仪器检测下限、正常参考范围下限等指标有关，有时也以浓度单位表示。要根据K值、仪器稳定性、方法允许变异而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力浓度的分析误差应≤10％，其试剂空白速率应≤4．0U／L。一些仪器的程序参数中没有此参数，但我们应在试剂空白的测定资料中关注它，若资料波动大，须查找试剂或仪器原因。

    3．试剂空白的日常监测测定方法设置了试剂空白的项目，都要先行作试剂空白测定，在样品测定计算中自动扣除。由于试剂空白不是在每一个样品测定中实时测定并扣除，当样品测定中试剂的变化在未达到参数设置限值时不易发现，试剂空白扣除会产生误差。所以，应根据试剂的稳定性确定试剂空白及相关的校准的测定频率。连续监测法的试剂应每天(尤其在换另瓶或另批号试剂时)常规测定此参数。对样品的异常结果．也应及时对其测定吸光度资料(包括与试剂空白有关的资料，例如PO点读数)观察分析。

    4.有的半自动生化仪没有试剂吸光度上限和下限设定，但一般在测定屏幕都显示初始吸光度值，应人工加以判断。酶活力测定结果呈负值，有时可能与试剂空白错误有关。 www.labdd.com

    5．试剂吸光度上限和下限不是试剂质量的唯一指针。因此，一定的校准频率和室内质控是质量保证的必需手段。我们在实际工作中就遇到酶活力测定的试剂空白数据在规定限值内，但质控物测定结果连续偏低，病人结果因每天标本少而难以判断，最后发现是试剂质量下降。