自然杀伤细胞和淋巴因子激活杀伤细胞的杀伤功能实验

　　
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。

　　
通过将同位素⁵¹Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞LiBr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4 小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的⁵¹Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。

K562 LiBr

3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2

培养瓶 培养板 CO2孵箱 液闪仪 计数仪

一、效应细胞的制备

　　
NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。

　　
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腹水）中纯化的淋巴细胞（1×10⁶ /ml）在含有高剂量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 诱导2～5 天而成。

　　
二、杀伤试验

　　
主要有4 h ⁵¹Cr释放法和³H-TdR释放法，前者要求⁵¹Cr质量好，同位素半衰期较短，操作所需时间短；后者需要无菌操作，所需时间较长。

　　
1.  ⁵¹Cr 4 小时释放试验

　　　　　　　　　
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562，LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶ /ml

（2）取1×10⁶细胞（0.5 ml），加Na₂⁵¹CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h，每15 min轻轻振摇一次

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗涤3 次，每次800 rpm，5 min

（4）重悬细胞浓度1×10⁵ /ml

（5）96 孔V型或U型培养板中，每孔加100 μl（1×10⁴细胞），每份3 个复孔

（6）每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 μl，1 ％TritonX-100；自然释放组加100 μl完全培养基

（7）200 g 离心1 min，37 ℃、CO₂孵箱 4 h，200 g 离心1 min

（8）每孔取出100 μl上清，γ计数仪上测定cpm值

　　
（9）计算
 

　　　　　　　　　　实验组cpm-自然释放cpm

特异性杀伤率（％）＝─────────────

　　　　　　　　　　最大释放cpm-自然释放cpm

　　
2.  ³H-TdR释放试验

　　　　　　　　
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×10⁶ /ml，加³H-TdR 20 μci

（2）37 ℃孵育2～3 h

（3）用10 ％FCS RPMI1640洗涤3 次，每次800 rpm，5 min 调整细胞浓度为1×10⁵ /ml

（4）96 孔U型或平底培养板中，每孔加100 μl（1×10⁴细胞），每份3个复孔

（5）每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加100 μl 1％TritonX-100，自然释放组加100 μl完全培养基

（6）CO₂孵箱培养18～24 h

（7）每孔吸出100 μl上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15 ％）和DNA酶（终浓度为0.0125 ％）

（8）继续孵育30 min

（9）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上

（10）干燥后，移入液闪瓶中，加入1 ml闪烁液，β液闪仪中测cpm值

（11）计算
 

　　　　　　　　　　　 实验组cpm

特异性释放率（％）＝(1- ────── )×100％

　　　　　　　　　　　 对照组cpm

1.  每次试验最好取3～4 个不同效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1。

　　
2.  诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。

　　
3.  避免同位素污染。

　　
4.  根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞。
 

（1）1个溶解单位（Lytic unit，LU）为一定效应细胞30 ％溶解（杀伤）5×10³靶细胞（K562）的水平。

（2）如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2梯度的细胞洗涤后调整细胞浓度为5×10⁶ /ml，移入试管，加入2 mlFCS和2 ml 1×10⁸ /ml SRBC，100 g离心5 min，29 ℃孵育1 h，轻轻重悬细胞，叠加于3 ml Ficoll上，400 g室温下离心30 min界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可>90％。

　　
（3）在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH₄Cl方法，因为后者可降低NK功能。

　　
（4）在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，不同小鼠系NK活性有明显的差别
 

（5）3周以内或超过3个月以上小鼠的NK水平一般很低。