荧光分光光度计在使用时应该设置哪些参数？

　　荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。

　　荧光分光光度计工作参数条件的选择

　　1.激发波长的选择

　　该怎么确定激发波长与发射波长呢?对许多仪器初学者来说，这是个令人感到困扰的问题。如果仪器有三维扫描功能，那就比较简单，放样品进去，按照说明书要求做三维荧光扫描，可以很方便地确定出合适的激发波长与发射波长。如果仪器没有三维扫描功能，一般的方法如下。

　　首先，将仪器的激发波长(λem)先设定为200nm，然后进行发射(EM)模式扫描，发射波长(λem)扫描范围暂设定为210～800nm，记录所有出现的峰值波长；改变激发波长(λem)后再扫描，如第二次发射图谱中的某个(或某些)峰的位置没有位移(或位移很少)，一般来说这个(或这些)峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高(或峰面积)发生改变。

　　然后，将确定的荧光峰的波长作为发射波长(λem)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长；如果仅出一个激发峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(EM)扫描，可以得到具有良好信噪比的结果；如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰，则根据经验来选择，一般应选择峰形、高度适合且有一定带宽的峰作为激发波长。也可以参考荧光光谱的特性——激发光谱与发射光谱呈镜像的特点来确定激发波长。

　　2.滤光片的选择

　　在进行发射图谱扫描分析时，根据斯托克斯定律，设置的激发波长要比发射波长短，例如，激发波长λex=260nm，则发射起始波长应该从大于260nm的波长开始，比如270nm，发射结束波长为870nm。这样一来，在激发光的2倍波长(520nm)、3倍波长(780nm)处都会出现激发波长的尖锐的倍频峰，若与荧光光谱峰重叠，将会对测试产生干扰，需选用合适的滤光片将其滤掉。

　　倍频峰就是激发光的散射峰，虽然波长扫描到双倍波长的时候出现，但实际波长却是激发波长，可以通过增加高通滤光片来去除倍频峰。高通滤光片一般放在发射处，片上都标明其可以滤除的最大波长。也就是说，体系中增加高通滤光片后，比其上所标波长低的光，也包括这些光的二倍波长光、三倍波长光，会被滤掉；而比其所标波长高的光则可以顺利通过。

　　3.狭缝的设置

　　荧光强度跟很多因素有关，如分子结构、存在状态、溶液浓度或薄膜厚度、温度、选择的激发波长、测试狭缝宽度等因素。荧光强度在不同仪器上的测量值存在较大差异，不具有可比性，但是其峰位还是较容易确定的，可以用来判断何种物质。进行荧光定量分析，必须固定一些条件。

　　狭缝的大小对荧光强度很重要，狭缝大小可根据你所测物质的荧光强度大小作出适当的调整。在同一浓度，如荧光强度过大，超过仪器量程，可减小狭缝。但是，需要指出的是，不能仅凭狭缝的大小来改变荧光强度，还要考虑分辨率的问题。对于荧光扫描而言，狭缝加大可以使荧光强度提高同时重现性得到提高，但是分辨率随之降低。狭缝决定分辨率，仪器其它结构已经固定(光栅的刻线数、焦距以及综合的线色散系数)，狭缝大小就决定分辨率的高低。对于实际使用，狭缝大小需要和测定的峰的半峰宽相匹配，过大，峰就变形了。狭缝大小也决定了光通量大小。按照经验数值，狭缝开大1倍，光通量将增大4倍。

　　4.步长的设置

　　测量的步长小，测量会慢些，好处足图谱细腻些；步长大，测量速度快，谱图就显得粗糙些。步长设置应该小于需要测量最小半峰宽的1/5，因为步长会与分辨率相关的。原则上，步长应小于3倍的狭缝宽度。