荧光原位杂交实验

用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

人的MyoD1（MYF3)基因探针 人外周血中期染色体细胞标本

指甲油 甲酰胺 氯化钠 柠檬酸钠 氢氧化钠 吐温20

恒温水浴锅 培养箱 染色缸 载玻片 Nikon E-400荧光显微镜 盖玻片 封口膜 200μL移液器 暗盒

1.  探针变性

将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。

2.  标本变性

（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。 

（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。 
 

（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。

3.  杂交

将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4.  洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

（1） 杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。 
 

（2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。 

（3） 在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。 

（4） 在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。 
 

（5） 取出玻片，自然干燥。 
 

 （6） 取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5.  杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

（1） 在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。 

（2） 去掉保鲜膜，再加150 uL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40 min。 

（3） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。 

（4） 在玻片标本的杂交部位加150 uL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。

（5） 去掉保鲜膜，加150 uL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。 

（6） 取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。 

 （7） 重复步骤（1）、（2）、（3），再于2xSSC中室温清洗一下。 
 

 （8） 取出玻片，自然干燥。 
 

 （9） 取200 uL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6.  封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7.  荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择

相关溶液的配制

1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。

2.去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。

3.体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。

4.体积分数50%甲酰胺/2×SSC：100 mL甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL水。

5.体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。

6.杂交液：8 μL体积分数25%DS，20 μL 20×SSC混合。（或40 μL体积分数50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O混合）取上述混合液50 μL，与5 μL DF混合即成。其终浓度为体积分数10% DS，2×SSC，体积分数50% DF。

7.PI/antifade溶液

PI原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为100 μg/mL，取出1 mL，加39 mL双蒸水，使终浓度为2.5 μg/mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10 mg/mL，用0.5 mmol/L的NaHCO3调pH值为8.0。取上述溶液1 mL，加9 mL甘油，混匀。

PI/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1:9比例充分混匀，——20℃保存备用。

8.DAPI/antifade溶液：用去离子水配制1mL/mg DAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。

9.封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

10.封闭液II：体积分数5%  BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

11.荧光检测试剂稀释液：体积分数5%  BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

12.洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至500 mL，加Tween20 500 μL。

相关溶液的配制

1.20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g柠檬酸钠，加水至1 000 mL（用10 mol/L NaOH调pH 至7.0）。

2.去离子甲酰胺（DF）：将10 g混合床离子交换树脂加入100 mL甲酰胺中。电磁搅拌30 min，用Whatman l号滤纸滤。

3.体积分数70%甲酰胺/2×SSC：35 mL甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL水。