荧光定量PCR技术原理及利用

荧光定量PCR技术是在PCR技术的基础上发展而来的，PCR技术是由人创造的模拟基因组DNA自然条件下的复制的一项技术。我们都知道，基因组要完成复制才能发生细胞的分裂；如果基因组不能复制，那么随着细胞的分裂，基因组会被逐渐稀释。正是由于基因组的半保留复制，才使得物种的繁衍得到生生不息。正如上所述，基因组的复制是以半保留复制的方式进行的；在复制时DNA双螺旋链解旋，裸露出需要互补配对的碱基，这个时候细胞内的dNTPs、DNA
polymerase等成分纷纷进入功能空间，随着时间的推移一条与原来模板链互补配对的新链产生了。人们在阐释了基因组的复制以后，开启了创造性模拟这一自然发生的生化反应的探索实践，并最终于1985年由美国的K.B.Mullis成功发明，Mullis还因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。（试吧商城【shibamarket】）
简单来说，PCR技术就是将引物（可以与DNA单链模板互补配对的一小段DNA寡核苷酸链）、模板、dNTPs、DNA
ploymerase、反应Buffer、ddH2O等配制成一个反应体系，然后按照反应所需要的温度顺序进行温控式执行反应；经过数十个循环以后，产生不计其数的与原始模板序列几乎一样或互补配对的新生序列，这样就得到了大量的用于后续实验的DNA模板。（试吧商城【shibamarket】）
荧光PCR技术是在PCR技术日趋完善的基础上，为了能实时监测PCR反应过程中的所需DNA片段含量的发展变化，科研工作者又对DNA与荧光小分子的相互作用进行了深入研究并取得大量积极的成果；而后将两项技术结合起来，并融合了快速发展的计算机软件技术，形成了这种可以既能精确地控制PCR反应所需的温度变化要求，又能实时地收集反应体系受到激发光照射后产生的荧光信号，还能将这种荧光信号转变为计算机软件可接受并处理的电子信息；并最终诞生了实验人员通过计算机软件就可以控制和检测普通PCR体系的Real
Time
qPCR技术。Real
Time
PCR体系与一般PCR体系在成分组成上多出了小分子荧光染料或荧光探针这一成分。在温度控制方面多出了DNA熔解这一程序，就是通过梯度式地变化温度，使DNA双螺旋逐步分离开来；因为荧光染料只有嵌合在DNA双螺旋上才能被激发产生荧光，所以通过检测荧光信号的变化峰值就可以推断出引物的特异性如何，换句话说就是可以分析所扩增的DNA双螺旋有几种序列组成。（试吧商城【shibamarket】）
通过此技术，可以使实验人员利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；并利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-Time
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。当然，反转录酶的发现和利用使Real
Time
PCR技术的适用范围由现成DNA为模板扩大到间接地以RNA为模板。该技术目前已被广泛应用于监测处理后细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因芯片、验证引物特异性、检测siRNA干扰的实验结果、检测非翻译RNA的表达变化、检测细胞富集度、验证表观遗传学的影响等等。