荧光实验方法的选择

在荧光分析中，可以采用不同的实验方法以进行分析物质浓度的测量。其中最简单的是直接测定的方法。只要分析物质本身法荧光，便可以通过测量其荧光强度以测定其浓度。许多有机芳族化合物和生物物质有内在的荧光性质，通常可以直接进行荧光测定。若有其他干扰物质存在时，则应预先采用掩蔽或分离的办法加以消除。
  对于有些物质，它们或者本身不发荧光，或者因荧光量子产率很低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。间接测定的办法有多种，可按分析物质的具体情况加以适当的选择。 第一种方法是荧光衍生化的办法，即通过某种手段使本身不发光的待分析物质转变为另一种发荧光的化合物，再通过测定该化合物的荧光强度，可间接测定待分析物质。例如许多无机金属离子的荧光测定方法，就是通过使它们与某些金属螯合剂反应生成具有荧光的螯合物之后加以测定的。某些不发光的有机化合物，可以通过降解反应、氧化还原反应、偶联反应、缩合反应、酶催化反应或光化学反应等办法，使它们转化为荧光物质。例如维生素B1本身不发荧光，但可在碱性溶液中用铁青化钾等一些氧化剂将它氧化为发荧光的硫胺荧[9]。
  如果分析物质本身不发荧光，但却具有能使某种荧光化合物荧光猝灭的能力，由于荧光猝灭的程度与分析物质的浓度有着定量的关系，那么，通过测量荧光化合物荧光强度的下降程度，便可间接地测定该分析物质。例如大多数过渡金属离子与具有荧光性质的芳族配位体配合后，往往使配位体的荧光猝灭，从而可间接测定这些金属离子。倘若待分析物质不发荧光，但可以通过选择合适的荧光试剂作为能量受体，在待分析物质受激发后，通过能量转移的办法，经由单重态-单重态（或三重态-单重态）的能量转移过程，将激发能传递给能量受体，使能量受体分子被激发，再通过测定能量受体所发射的发光强度，也可以对分析物进行间接测定。例如在滤纸上用萘作敏化剂以测定低浓度的蒽时，可使蒽的检测限提高达3个数量级。以此类推，低浓度的菲也可由萘敏化而产生较强的荧光。在荧光分析中，由于每种荧光化合物具有本身的荧光激发光谱和发射光谱，因而在测定时相应的有激发波长和发射波长两种参数可供选择，这在混合物的测定方面比分光光度法具有更有利的条件，有时可简单地通过选择合适的激发波长或发射波长，达到选择性测定混合物中某种组分的目的。
   在选择激光波长和发射波长之后仍无法达到混合物中各组分的分别测定时，还可仿照分光光度法中联合测定并解联立方程式的办法；对于混合物的荧光联合测定，也有不采用联立方程式而采用校正图的办法；对于发射光谱相互重叠的双组份或三组分荧光混合物的同时测定，在合适的条件下可应用类似于双波长分光度的原理，采用多波长荧光法进行测定。上述这些办法提出时在当时的仪器条件下是有效的、可以解决问题的，对拓宽荧光分析的应用范围是发挥一定作用的，但毕竟方法比较繁琐、费时。在目前的情况下，由于荧光分析在法学和仪器方面都有了很大的发展，就不必采用上述几种方法，而可以采用更为先进的方法，诸如本书后面将要介绍的同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定等方法，以及化学计量学的方法，来达到分别测定或同时测定的目的。与常规荧光分析法相比，同步荧光分析法具有简化谱图、提高选择性、减少光散射干扰等特点，尤其适合多组分混合物的分析。同步荧光扫描技术由Lloyd首先提出，它与常用的荧光测定方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长（或发射波长）构成光谱图，称为同步荧光光谱。
   根据激发和发射两种波长在同时扫描过程中彼此间所保持的关系，同步荧光分析法可分为如下四种类型：第一种类型在同时扫描过程中使激发波长（emex常数），这种方法称为恒（固定）波长同步荧光分析法（constant wavelength synchronous fluorescence spectrometry, CWSFS）,即习惯上所说的同步荧光法，是最早提出的一种同步扫描技术；第二种类型则以能量关系代替波长关系，在两个单色器同时扫描过程中使激发波长与发射波长之间保持固定的能量差，这种方法称为恒能量同步荧光分析法(constant-energy synchronous fluorescence spectrometry,CESFS) ；第三种类型称为可变角（或可变波长）同步荧光法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry,MISFS），其扫描路径表现为基体（将干扰物视为基体）的等荧光强度线。
   同步荧光扫描测定具有如下优点：1简化光谱；2窄化谱带；3减小光谱的重叠现象；4减小散射光的影响。
  三维荧光光谱是近几十年中发展起来的一种新的荧光分析技术。这种技术区别于普通的荧光分析的主要特点在于它能获得激发波长与发射波长同时变化时的荧光强度信息。普通荧光分析所测得的光谱是二维谱图，包括固定激发波长而扫描发射（即荧光测定）波长所获得的发射光谱，和固定发射波长而扫描激发波长所获得的激发光谱。但是，实际上荧光强度应是激发和发射这两个波长变量的函数。描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，即为三维荧光光谱。
  另外，荧光分析法还有时间分辨和相分辨荧光分析法、荧光偏振测定、低温荧光分析法、固体表面荧光分析法、动力学荧光分析法空间分辨荧光分析技术、单分子荧光检测、荧光免疫分析法和导数荧光分析法。固体表面荧光测有两种方法：一种是直接测定固体物质表面的荧光；另一种是将待测组分吸附在固体物质表面，然后进行荧光测定。才用的固体物质品种众多，有硅胶、氧化铝、滤纸、硅酮橡胶、乙酸钠、溴化钾、蔗糖、纤维素等。固体表面荧光测定有两种不同形式，一为反射式，一为透射式。采用反射式时，激发光源和荧光检测器同在样品的一边，一般互成45°角。紫外激发光聚集于固体表面样品斑点上，样品发生的荧光经单色器散射后由检测器检测。采用透射式时，一般将样品吸附在透明的薄层色谱板上，激发光源和检测器分处在样品的两边。紫外激发光经滤光片除去可见光，聚集在样品斑点上而发可见光荧光，荧光透过薄层板再经单色器散射后由检测器检测。在固体表面荧光测定中，待测物质吸附在固体物质的小颗粒上。入射光进入固体物质而在颗粒的边界上发生多重反射，成为漫反射发生的荧光也在颗粒之间发生反射，形成了激发光和荧光两者的散射。在这样复杂的情况下，固体表面发生的荧光强度除与照射面积和荧光物质的数量有关外，还受众多因素的影响，如散射光强度、吸附层厚度、固体颗粒的大小、固体表面对激发光的吸收、测定的方式、观测发光信号的角度等。