荧光显微镜成像质量的决定因素

荧光光学系统的成像质量主要取决于像的衬度和像的亮度，像的衬度是由样品中激发出的荧光与背景上观察到的光之比决定的。背景光包括透过截止激发光的滤色片的杂散激发光，样品组织成分的自发荧光和光学系统的自发荧光和杂散光，在荧光显微术中尽全力要解决的是既获得最佳的像衬度，同时又维持像有足够亮度，这两者往往是矛盾的。例如用极窄波带滤色片激发时仅利用了极少的光能，背景暗了但荧光亮度也弱了。在应用时，只能兼顾，合理的权衡以决定取舍。

荧光显微光学系统需要优先考虑的是：

(1) 光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料，不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光，不但会增加背景光，有时还会混淆观察荧光图像。

(2) 光学系统的参数选择中, 应将获得最大光能作为第一考虑因素。

照明系统中集光镜应选用最大的包容角； 采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳，以期望获得高效率的均匀照明。

收集荧光成像的物镜，因为像面照度与数值孔径NA 2 成正式，为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达015；20×达0175；40×达019；油镜40×达113。

双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率，采用镀膜技术可大大地减少光能的损失，它可比一般双目镜筒透射率提高一倍，这对弱荧光物质观察是必须的。

目镜放大率不宜选大，因为象面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同，当用613×目镜时，照度定为100% ，换上1215×时，照度约为25%，因此常在4×～ 613×之间选用。

由此表明，用不同物镜和目镜组合成同一倍率的显微镜时，象面照度和曝光系数可相差数倍，对于荧光观察最佳组合是选用低倍率目镜和NA 大的物镜最为合适。

(3) 作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的，特别是紫外光要通过的部件，如照明系统，聚光镜以及物镜，要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好，因为铝在UV 和V 区反射率在90% 以上，而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线，在紫外区通过处不宜用作胶合剂。