荧光显微镜技术原理和方法

)训练目的

    学习荧光显微镜的使用；了解荧光显微镜技术原理和方法。

2)实验材料

    生物素标记的一dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的duUTP(Digoxingening—11一dullP)1 nmol／μL,TdT酶(25 U／μL)，反应缓冲液，洗涤缓冲液，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素(2.5μg/mL)或抗地高辛抗体(1：30)，PI染液(含PI 5μg/mL)，PBS缓冲液，盖玻片，培养的贴壁细胞，悬浮细胞的甩片或涂片，冰冻切片，常规石蜡切片。

3)操作步骤

①固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4％多聚甲醛固定30 min(4℃冰箱)后，用80％酒精再固定2 h(一20℃冰箱)；常规4％中性福尔马林固定、石蜡切片进行脱蜡、水合。

②洗涤：将玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5 min，洗3次。

③反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μL／cm2滴加反应液(每50μL反应液含TdT酶O．5μL，标记的一dUTP 1μL)，使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1 h。

④终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置于盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤2次，每次5 min。

⑤FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μL／cm2滴加FITC反应液(含FlTC 2．5μg／mL)，室温下避光孵育10 min。

⑥洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗2次，每次5 min。

⑦PI复染：将玻片置于盛有Pl染液的染色缸内，室温下避光染色30 min。

⑧封片：用盖玻片直接盖在含PJ染液的玻片上，也可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，镜检观察。

4)结果判断

    用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光(波长488 nm)，所有的细胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。