(1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。
(3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
(4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。
(5) 培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。
(6) 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
(7)提取蛋白并用于荧光素酶检测。
(8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。
(9) 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。
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