药物体外代谢模型之肝微粒体模型

对于那些体内代谢率低、毒性大或缺少灵敏的检测手段的药物来说，药物体外代谢研究可以排除内因素的干扰，为整体实验提供可靠的理论数据。肝微粒体模型是实验室常见的研究药物代谢的体外模型之一，具有代谢快、易大量操作等优点，可广泛用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究。

生物大分子药物分子量大、结构复杂，与小分子药物相比具有独特和复杂的PK 特征，如存在靶受体介导的消除和FcRn 转胞吞等，它们的体外代谢研究也不同。对于大分子药物来说，其一般不经CYP 450 酶代谢，体内消除途径主要有肾小球滤过、酶水解、受体介导的胞吞消除和抗药物抗体介导的消除。

肝脏是药物的主要代谢器官，富含参与药物的一相代谢和二相代谢的混合功能氧化酶系统，其中90%药物主要是由细胞色素P450酶参与进行生物转化。采用从肝脏或肠提取的微粒体，加入还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱质谱联用法等测定方法对原性药及代谢产物进行测定，其中肝微粒体法最为常见。

肝微粒体法进行药物体外代谢研究具有制备方便容易、重现性好、酶混合体易保存和孵育条件易优化、公认的亚酶底物、抑制剂和灵敏有效等优点。上海美迪西在药代动力学体外研究方面有丰富的经验，体外研究是指代谢稳定性、P450诱导和抑制、代谢途径研究、代谢产物鉴定等研究项目，涉及的动物有大鼠、小鼠、兔、狗、猴子等。

 1、大鼠肝微粒体的制备

（1）购买实验动物 SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g。

（2）大鼠肝脏灌流，购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg²kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。

（3）灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mM EDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎、匀浆。

（4）将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。

（5）保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。

（6）保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下 100000g再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。

（7）将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。

（8）肝微粒体蛋白浓度测定，依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)。首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。

（9）肝微粒体中p450酶含量测定，根据omura and Sato的方法。用Tris-HCL缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3-0.5mg/ml，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400~500nm扫描基线；参比池和样品池都加少量的Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品通CO气体30s，再次扫描，记录450nm和490nm处的吸收光，按照Beer定律计算CYP450的含量。

2、肝微粒体药物体外代谢模型的作用

（1）肝微粒体药物体外代谢模型可以用于药物清除的研究

预测药物在体内的清除率，其步骤是首先通过测定药物代谢的酶动力学参数获得Vmax及Km，再运用合理的动力学模型来推测药物代谢清除率。如研究者在人肠微粒体孵育体系中研究抗艾滋病候选药3-氰甲基-4-甲基-DCK（CMDCK）的肠道代谢，测得消除各个半衰期，应用WellStirred模型对肠微粒体的动力学参数进行外推，预测得到其体内肠道清除率为3．3mL·min－1·kg－1，接近于人肠道的平均血流量（4．6mL·min－1·kg－1）。由此推测，CMDCK的肠道代谢可能对其口服首过效应有显著影响。

（2）肝微粒体药物体外代谢模型可以用于高通量药物筛选研究

新药开发的早期阶段，常利用肝微粒模型对候选化合物药动学特点进行初筛，以便在研究开发的早期确定该候选化合物是否有继续开发的价值。如使用肝微粒体孵育模型（体外模型）和等时间点样品混合（体内模型）的方法，建立多个化合物合并检测的LC-MS/MS分析方法，对化合物的药代动力学性质进行快速筛选，通过体外代谢稳定性研究，结合化合物可以进一步开发。

（3）肝微粒体药物体外代谢模型可以用于药物相互作用的研究

抑制或诱导P450酶（如CYP3A4）的药物可以影响合并用其他药物的药动学，从而影响血浆中药物的暴露量（以AUC的变化表示）导致药动学DDI。通过大鼠肝微粒体进行藁本内酯代谢的酶促反应动力学研究，通过特异性抑制实验探讨藁本内酯代谢的主要同工酶。结果显示，酮康唑、甲氧苄啶、α-萘黄酮显著性抑制藁本内酯的体外代谢，得出CYP3A4、CYP2C9、CYP1A2是参与藁本内酯代谢的主要代谢酶，CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6没有明显的参与。

3、肝微粒体药物体外代谢模型的缺点：

（1）由于制备过程完整的结构遭到破坏，在体外孵育体系中更容易导致非特异性反应；

（2）外侧细胞膜的去除导致转运蛋白（如Pgp）的丢失，在研究肠道代谢影响很大；

（3）缺少代谢所需要的完整的酶反应体系，需要加入适量的辅助因子NADPH；

（4）一些药物代谢酶在制备过程中被去除了，如位于细胞质中的代谢酶。