药物对动物体内NK细胞活性的影响实验

实验方法原理

肺癌是最常见的严重严胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一， 机体免疫功能低下，与肺癌的发生发展密切相关。

实验材料 小鼠

试剂、试剂盒 RPMI1640 培养基中止液Hank. s曲拉通X-100

仪器、耗材 酶联免疫监测仪96 孔24 孔平底培养板离心沉淀机

实验步骤

1.  动物分组及用药

（1）将40只小鼠随机分为正常对照组10只和荷瘤组30只。

（2）正常组于右腋下皮下注射生理盐水0.2 ml/只，荷瘤组右腋下皮下注射瘤细胞悬液0.2 ml/只。

（3）荷瘤组随机分为3组，并于肺俞及接种局部脱毛（腧穴定位参考林文编5实验针灸学6），于次日开始治疗。

（4）模型对照组贴敷无药硬膏。

（5）局部贴敷组用抗癌膏贴敷接种局部。

（6）穴位贴敷组用抗癌膏贴敷肺俞穴及接种局部，各组均隔日更换膏药，共治疗14天。

（7）正常对照组不做药物处理。于第15日处死小鼠，摘眼球取血，取脾脏。

2.  检测方法：脾NK细胞活性检测。

（1）脾NK细胞的制备

①无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，离心后取沉底脾淋巴细胞

②用含10%FCS的1640完全培养液移入100 ml 细胞培养瓶中

③37℃、5%CO2下培养4 h，调整细胞浓度为6×106/ml，备用。

（2）靶细胞：传代培养的YAC-1细胞在实验前一天换液，调整浓度为3×105/ml。

（3）NK细胞杀伤活性的测定

①用96孔细胞培养板。

②每份样品设

a：效应细胞自发释放孔（效应脾细胞0.1 ml，完全培养液0.1 ml）

b：靶细胞自发释放孔（靶细胞0.1 ml，培养液0.1 ml）

c：杀伤实验孔（靶细胞0.1 ml，效应脾细胞0.1 ml）

d：最大杀伤实验孔同c，每孔设3个重复孔，离心，弃上清液0.1 ml，加入0.1 ml 2%X-100。

③于37℃、5%CO2下培养24 h，离心（1000 rpm，5 min）。

④弃上清液，每孔加NAG酶反应物液100 ul，置湿盒37℃温育40 min。

⑤每孔加中止液100ul，在酶联检测仪410 nm处测A值，分别以a、b、c、d表示。

⑥按下公式计算NK细胞杀伤活性：细胞毒指数（CI）=（a+b）-c（a+b）-d×100%。

3.  IL-活性测定：

（1）脾细胞制备同上。

（2）IL-2的诱生

①将6×106/ml脾细胞悬液加入24孔培养板中，调整细胞浓度为10 ug/ml。

②37℃、5%CO2下培养48 h（1000 rpm，10 min）收集上清液。

③无菌塑尖管为待测样品，-20℃保存检测活性。

（3）活性测定

①以IL-2依赖细胞株CTLL-2为靶细胞，用20%FCS的1640培养液调整浓度为2.5×105/ml，加入96孔培养板，每孔100 ul。

②再加入100 ul待测样品，每份样品设三个重复孔，并设阴性对照孔。

③培养48 h后离心（2000 rpm，10 min），弃上清液。

④加NAG酶反应底物100 ul，置湿盒37℃温育40 min后，每孔加中止液100 ul，在酶联检测仪410 nm处测A值。

⑤按下列公式计算CTLL-2增殖率，表示IL-2活性。增殖率（%）=样品A值-阴性对照孔A值阴性对照孔A值×100%。

4.  统计方法采用 t 检验。

其他

一、讨论

NK细胞是一类重要的免疫调节细胞，它具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等作用，它的抗肿瘤机制为：

（1）通过其表面的受体，识别肿瘤细胞上的靶结构直接杀伤之，或通过释放可溶性介质来杀伤肿瘤细胞。

（2）NK细胞表面有FcCR受体，它可以与覆盖在肿瘤细胞上的抗体的Fc段相结合，对肿瘤细胞发挥细胞毒作用。

（3）NK细胞能释放干扰素C（IFN-C）、I-l1、IL-2等细胞因子来加强抗瘤作用。

NK细胞处于机体抗肿瘤的第一道防线。对抑制肿瘤的生长、发展、转移都具有重要意义。IL-2在肿瘤免疫中也具有重要作用，其作用机制为：

（1）刺激NK细胞的生长，增强NK细胞的溶细胞活性。

（2）诱导CTL、LAK等肿瘤杀伤细胞的分化和效应功能。

（3）诱导肿瘤杀伤细胞产生IFN-C、TNF-a等细胞因子，增强抗瘤效应。

（4）活化巨噬细胞促进杀瘤效应，临床常用IL-2注射来抑制肿瘤取得一定疗效。

NK细胞表面具有IL-2受体，在IL-2刺激下可出现细胞增殖反应，并产生IFN-a等细胞因子，IL-2、IFN-a、IFN-C可协同作用提高NK细胞的活性，以IL-2作用最突出。NK细胞和lL-2之间相互促进而发挥杀瘤作用。

本疗法针对肺癌本虚标实证，以扶正祛邪为原则，益气滋阴、清热解毒、软坚散瘀为治则，选西洋参益气养阴，黄芪补气升阳，益肺固脾，鹿角胶补益肝肾，滋养精血，3味主药合用而调补阴阳益气养血；白花蛇舌草、山慈菇清热解毒；穿山甲、海藻软坚散结；水蛭、莪术破血逐瘀。

诸药合用而达扶正抗癌之效。抗癌膏贴敷肺俞穴，是因为肺俞穴为肺脏经气输注之处，位置又与肺脏实际部位相对应，为治疗肺疾之要穴，而且从俞穴的皮肤特点来看，背部皮肤较四肢为薄，药物易渗透至皮下组织而发挥疗效，故肺俞穴为穴位贴敷治疗肺癌的最佳穴位。

研究证实：抗癌膏中的黄芪，其药理成分黄芪甙能增强细胞免疫功能，促进IL-2产生，其水煎剂可促进NK细胞活性，西洋参中含的人参皂甙Rd，经体内动物实验证实，可以提高NK细胞活性和干扰素C的产生水平，增强免疫机能，增强小鼠抑瘤率，减轻瘤重；鹿角胶中含鹿茸精及胶质蛋白等，可以增加心、肾功能，3药合用，改善机体免疫功能。

白花蛇舌草、山慈菇为清热解毒药，可抑制或杀灭肿瘤细胞；水蛭、莪术等活血化瘀药可扩张血管，改善晚期肺癌的血瘀证，抑制血栓形成，减少肿瘤转移；海藻、穿山甲可升高机体白细胞，提高机体免疫功能，抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积。

本疗法用抗癌膏贴敷肺俞穴治疗肺癌的机理是：在药物和穴位的双重作用下，增强NK细胞活性与T细胞分泌IL-2的能力，提高干扰素的诱生水平，从而改善机体的免疫功能。肿瘤病人，尤其是进展期病人，其外周血中T细胞分泌IL-2水平低于正常人，NK细胞活性也低于正常人，因此用抗癌膏进行肺俞穴贴敷，可以通过提高NK细胞活性和IL-2诱生水平来提高病人免疫功能，从而对肺癌起到治疗作用。