蔬菜中有机磷农残快速检验法——酶抑制率法(分光光度法)

实验概要

学习酶抑制率法测定果蔬有机磷和氨基甲酸脂类农药残留的原理和方法，注意实验过程的操作要点。

实验原理

根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。

主要试剂

1. pH8.0缓冲液  分别称取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL蒸馏水中。

2. 乙酰胆碱酯酶(实验专用酶)  根据酶活力用缓冲溶液溶解，3 min的吸光值变化ΔA₀值应控制在0.3以上。摇匀后在0~5℃冰箱中保存，保存期不超过4天。

3. 底物碘化乙酰硫代胆碱  称取25.0 mg碘化乙酰硫代胆碱，用3.0 mL缓冲溶液溶解，在0~5℃下保存。保存期不超过2周。

4. 显色剂  分别称取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。

5. 可选用由以上试剂配置的试剂盒。乙酰胆碱酯酶的ΔA₀值应控制在0.3以上。

主要设备

1. 分光光度计或相应的农残快速检测仪；

2. 天平(0.01g)；

3. 恒温水浴或恒温培养箱。

实验材料

待测果蔬

实验步骤

1. 样品处理

选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 mL缓冲液，振荡1~2 min，倒出提取液，静置3~5 min，待用。

2. 对照溶液测试

先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂。摇匀后于37 ℃放置15 min以上(每批样品的控制时间应一致)。加入0.1 mL低物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA₀。

3. 样品溶液测定

先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA_t。

4. 结果计算：

              抑制率(%)=

        式中   ΔA₀——对照液反应3 min吸光度的变化值；

              ΔA_t——样品溶液反应3 min吸光度的变化值。

5. 实验结果判断：

当蔬菜样品提取液对酶的抑制率大于50% 时，表示样品中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果，对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。

检验结果记录：

注意事项

1. 对检验结果阳性的样品，需用其他方法进一步确定残留农药的种类和进行定量测定。

2. 酶抑制率法对部分农药的检出限为：

3. 葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株(体)蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株(体)蔬菜浸提法，减少色素的干扰。

4. 当温度条件低于37℃，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化

ΔA₀在0.3以上为准。注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照液3 min的吸光度ΔA₀变化值＜0.3。

5. 该法适用于大量蔬菜样本的筛检，不适用于最后的仲裁检测。