1．点样：
⑴ 样品的溶解：将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。
⑵ 薄层点样：用毛细管（0.5mm以下）或用专业点样器进行点样。
点样的要求：样点位置应在距离底边1-1.5cm处；点样量适当；样点直径小于2-3mm；间隔反复点样；多个样点时，间隔为2cm且处于同一条直线上。
经验做法：可先在PC或TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。
2．展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。
要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。详见P33。
注意事项：先悬空饱和、再入液展开；样点不能泡在展开剂中；薄层浸入时不能歪斜进入。
3．显色：用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。
显色的基本步骤是：一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。详见P34。
4．比移值的计算与定性、定量：展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf：
Rf＝(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离)
注意事项：薄层层析的Rf 值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。
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