蚜虫mtDNA12S／16SrRNA基因序列测定及系统发育分析

实验概要

线粒体DNA在分子进化中具有许多独特的优越性，mtDNA己成为研究生物(主要是动物)进化的重要材料。本研究所利用的mtDNA基因序列包括12SrRNA，16SrRNA以及12SrRNA和16SrRNA之间的序列，通过分析三种蚜虫mtDNA 12S/16SrRNA基因序列的进化，不仅揭示了三种蚜虫与已知其它蚜虫的该段序列的进化关系；同时结合这三种蚜虫mtDNA COI/COIF基因序列的进化特征，将更好的反应这三种蚜虫mtDNA的进化信息。

实验材料

本研究中的蚜虫为桃蚜、豆蚜、棉蚜。桃蚜、豆蚜、棉蚜在实验室内分别用萝卜、菜豆、黄瓜进行饲养；各种群分别置于50X50X50的正方体铁架外罩100目双层沙网内，饲养条件为20-22℃相对湿度60-70%。

实验步骤

1. 蚜虫总DNA的提取

   1) 向事先已编号的1.5mL离心管内分别加入20ulSTE缓冲液(100mmol/LNaCl，10mmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH8.0 )，然后分别将离心管置于冰上；

   2) 挑取新鲜单头成蚜虫放入离心管内，立即用塑料碾槌碾磨；

   3) 碾磨后将离心管置于冰上，重新取下一头成蚜虫放入另一个离心管内，重复第二步；

   4) 分别向离心管内加入1.6ul蛋白酶K (10mg/mL)；

   5) 简单离心后，37℃下孵育30min；

   6) 95℃初始变性5min；

   7) 简单离心后，-20℃保存或用2ul作为PCR反应的模板，立即进行PCR扩增。

2. PCR扩增体系和条件

使用一对特异性引物(Moran et al., 1999 )扩增蚜虫mtDNA-12S/16SrRNA基因。

上游引物为：5’-ATGTTTTTGTTAAACAGGCG-3'；

下游引物为：5’-AAACTAGGATTAGATACCCTATTAT -3'。

每50uL扩增反应体系含：2uL DNA模板，30.6uL ddH₂O，5uL l0Xbuffer，5uL MgCl₂(25 mmol/L)，4uLdNTPs ( l0mmol/L each)，0.4uLTaq DNA聚合酶(5U/u，大连TaKaRa公司)，上游和下游引物各1.5uL ( 20umol/L each )。

PCR反应条件为：94℃预变性4min；接着92℃变性lmin，50℃退火1 min，72℃延伸1 min共30个循环。

扩增产物的检测：取PCR反应产物5-9uL，在1.0%(g/mL)的琼脂糖凝胶上60V电压电泳30min，最后在Bio-Rad Gel Doc EQ凝胶成像系统下观察。

3. 序列测定与分析

获得的DNA序列先提交到GenBank数据库中，然后利用“BLAST”，工具(NCBI站点)进行序列分析、DNA序列检索；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用BioEdit软件进行序列编辑；用Clustal X软件(Thompson等，1997)进行序列比对(alignment )；比对结果输入MEGA2.1软件(Kumar等，2001)，采用距离法计算各样品间的遗传距离，并基于Kimura-2 Parameter模型，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树，通过自展1000次检验获得系统树分支的置信度。