86) 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30，但这个柱直径 的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 还有个小问题，是不是G后面的数字越大，就刚性越差，越容易受外因素影响？
是的,G后面的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。
88) 我表达的是带有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。
89) 在做WB，因为是血清标本，含有较多的白蛋白，可能影响我的实验结果。我请问过ptglab楼主，他推荐我来这儿问一问。请问高手有什么方法吗？哪一种比较简单经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我觉得很快也很特异，样品直接穿过柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，我们这里就有这个填料。
90) 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品目的蛋白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？
凝胶过滤处理样品量主要是受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%左右，如果是除盐可以上到20%左右。
其他的主要是上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用说明。
91) 我问的意思 是在纯化过程中，如果蛋白酶抑制剂去掉了，而该蛋白酶还未去掉，我担心此蛋白酶还会消化我的目的蛋白，请问我说得有没有道理？有没有必要考虑？
你可以用抗体做WB检测你的纯化的蛋白，如果确实有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。
92) 离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？
抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。
93) 破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。
那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状， 沉不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？
另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它 解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢
你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.
亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.
95) chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?
亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.
这