蛋白质免疫印迹实验

操作流程

(1)制备与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜一张，吸水滤纸 2 张 (Whatman 3 MM)。

(2) 将凝胶在转印缓冲液中浸泡 30m in，将转移膜、滤纸和海绵垫也在同样的缓冲液浸湿。

(3) 安装转印「夹心三明治」。将凝胶放置在玻璃平板上，然后将一张浸湿的滤纸放在凝胶上，如果是米用半干转的方式进行蛋白质转印，那么宜用三张滤纸。将玻璃板翻转 ，并且将其放置在海绵垫上，用一个小的刮铲，轻轻地将凝胶和滤纸从玻璃板上分开。然后将转印膜放置在凝胶之上，用一个圆筒状的物品，如铅笔或者玻璃棒放在膜上，轻轻地去除所有的气泡，然后将第二层滤纸放在转移膜上并且去除所有的气泡，如果采用半干转的方式进行蛋白质转印，那么这里也应该使用三张滤纸。需要加以注意的是，如果有气泡存在于凝胶和转印膜之间，那么将会影响蛋白质转印的效果。

(4) 将完整的转印「三明治」放置在转移夹中，然后将其放入转印槽中，将转印膜放置在靠近正极的一面（红色），而凝胶放置在负极的—面（黑色）。

(5) 电转印槽的准备。将预冷的缓冲液倒人转印槽中，如果有必要，可以设置一个缓冲液冷却系统。如果 采 用 Hoefe r 系统，那么至少需要 4L 缓冲液。转印缓冲液至少可以使 用 3 次 。但是，由于在转移的过程中，缓冲液会有所蒸发，因此在重新使用前，可能有必要补充一些新的缓冲液。对半干 转 印 而 言 ，缓 冲 液 附 着 于 滤 纸 上 ，转印完成之后弃去即可。

(6) 电转印时间。在 4°C ，90V 恒压的条件下转印 4 h , 或 者 恒 压 30V ，转 印 12 h ，在转印的过程中，需要用一个磁力搅拌器持续搅动缓冲液。在这两种条件之间，也可以使用其他的转印电压和时间，只要保持电压乘以时间的值为 36 〇即可。半干转移: 用 400m A 的稳定电流在室温下（约 23。 0 转 移 1〜2 h 。转移时间应该根据你的目的蛋白进行优化。转移过程中电压会有所变动，但 应 该 为 I 0〜2 〇 v 。

(7) 转印完成后，分开凝胶和膜。将凝胶放入考马斯亮蓝溶液中，将转印膜放置在另一个容器中，蛋白质面朝上。将 50mi 的丽春红 s 染色液加在转印膜之上，孵 育 1〜2 min，孵育过程中，轻轻地搅动染液。丽春红染液可以多次重复使用。

(8) 用水轻轻洗涤以去除膜上多余的背景染料。

(9) 在膜上，用铅笔将蛋白质标准品相对分子质量的位置标记出来。

(10) 将染色的转印膜拍照留存。

(11) 继续洗涤转印膜直到所有的染料被去除干净。如果在蛋白质富集的位置，染料仍有存留，那么可以用 NaKPS + Tween 2 0 洗 漆 转印膜 1〜2 min，然后用水浸洗几次，每次 1〜2 min

12.E C L 底 物
按 照 说 明 书 将 检 测 试 剂 1 和 检 测 试 剂 2 等 量 混 合 。（E C L W e ste rn blottin g reag e n ts, A m ersh a m B io scien ce/G E H ealthcare Life Sciences) 〇
试剂配制后，如果保存于 4°C ，底物液可以在 48 h 内重复使用。

实验假象以及故障的诊断和排除

在任何实验的操作和解释过程中，都可能有实验假象的出现，免疫印迹实验也不例外 。在应用增强化学发光检测系统与蛋白质 A 联合运用时，我们不时地看到的一些虚假的 、不一致的信号，这些是需要被排除的，因为它们不是代表特异性的蛋白质条带。这些信号偶尔会阻碍真实蛋白质信号的显现。我们推测这些信号可能是由于静电释放、凝胶和转印膜之间存在的气泡，或者是转印膜制造过程中本身的缺陷。

另外一个比较重要的问题是蛋白质条带的扭曲变形，这种情况常常发生在凝胶过程中上样「过渡」。例如，我们发现，当我们用含有牛血清的细胞培养上清进行电泳时，样本中血清白蛋白的含量会超过 1 % 〜2 % ，如果我们的目的蛋白相对分子质量与白蛋白相对分子质量相近时，它就会导致我们的目的蛋白质条带扭曲变形，给我们的目的蛋白的识别带来困难。如果可能，最好避免上样的待测样品中含有超过 2 % 的血清白蛋白。

一抗或者二抗与其他蛋白质或膜的非特异性或低亲和力的结合也可以导致背景信号的产生。封闭试剂也可能是一抗或二抗的非特异性靶蛋白。例 如 ，当应用蛋白质 A 作为第二检测分子的时候，用牛奶作为封闭试剂会导致背景信号的增强，这是由于牛奶中含有的 Ig G 2 能较弱地和蛋白质 A 结合 。

当检测分子直接和酶偶联的时候, 如和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶偶联，必须注意蛋白质印迹膜上是否有内源性的酶活性的存在。例 如 ，来源于兔胃黏膜的样本过氧化物酶能够在 SDS-P A G E 的分离过程中保存下来，从而在对膜进行化学发光底物反应时产生相应的信号 [55]。这种酶活性能够在抗体孵育前用 3 % H 20 2 对膜进行处理来消除。在使用链亲和素-生物素作为检测系统的实验中，内源性的生物素化蛋白质能够导致非特异性信号的产生。 V a ita itis 等 [66] 在研究细胞核提取物转录因子 NF-kB 的实验中，只将蛋白质印迹膜和链亲和素-辣根过氧化物酶进行孵育，然后用化学发光底物进行反应，也发现了4 个条带。为了解决这个问题，首 先 用 0 •25 g/m l 的链亲和素对内源性生物素进行封闭处理 ，然后用含 50ng/m l 的 d-生物素（d-biotin) 溶液清洗，以封闭结合在膜上的链亲和素。这 样 ，用生物素化的二抗和链亲和素-辣根过氧化物酶系统就只会识别 NF-kB 。