蛋白质分子量的测定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法）

一、原理

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量。

如在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate简称SDS）。这种阴离子表面活性剂浓度大于1mmol/L时，以1.4gSDS与1g蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了各种蛋白质天然电荷差别。巯基乙醇是蛋白质分子中二硫键的还原剂，使多肽组分分成单个亚单位。

SDS可打断蛋白质的氢键。因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变，此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似长椭园的棒状。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变与蛋白质的分子量成正比。

所以，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响，而只是按照分子的大小由凝胶的分子筛效应进行分离，其有效迁移率与分子量的对数成线性关系。这样就可以根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线得出末知样品蛋白质的分子量。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：小麦芽

（二）仪器设备：1.垂直板电泳槽及附件；2.直流稳压稳流电泳仪；3.微量进样器；4.其它常用用具。

（三）试剂：1. 下层胶缓冲液：18.17gTris，0.4gSDS，溶于水，用1mol/L HCl调pH8.8，定容至100ml。

2. 上层胶缓冲液：6.06gTris，0.4gSDS，溶于水，用1mol/L HCl调pH至6.8，定容100ml。

3.  Acr/Bis贮备液：30gAcr，0.8gBis，溶解后定容至100ml。

4. 10%过硫酸铵，用时现配。

5. 样品缓冲液：Tris0.6g，甘油5ml，SDS1g溶于水，用HCl调pH至8.0，再加溴酚蓝0.1g，巯基乙醇2.5ml，定容至100ml。

6. 电极缓冲液：Tris3.03g，Gly14.14g，SDS1.0g，溶于水，用HCL调pH至8.3容至1000ml。

7. 染色液的配制：45%甲醇，0.25%考马斯亮蓝R-250。

8. 脱色液：2.5%甲醇，10%醋酸。

9. 1.5%琼脂：1.5g琼脂溶于100ml电极缓冲液中，加热溶解。

10. 标准分子量蛋白质。

三、实验步骤

1. 电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5%的琼脂密封。

2. 样品处理：将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。

3.  制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5%的分离胶，混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即复盖2～3mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。

 4. 点样：用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液25μl，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。

 5. 电泳：加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～100伏之间，约3～4h后，指示剂达到距前沿1～2cm时，可终止电泳。

6. 固定：胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25%异丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。

7. 染色：取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染色2h。

8. 脱色：将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。

四、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算

根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm＝d2d1×D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。