蛋白质的分离实验

Sephadex G-25 葡聚糖凝胶G-25

磷酸盐缓冲液 碘化钾 碘 汞 蒸馏水 磺基水杨酸溶液

锥形瓶 量筒 层析柱 比色磁盘 试管 皮头滴管

一、试剂与器材
 

1.  Sephadex G-25。
 

2.  0.0175 mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
 

3.  奈氏（Nessler）试剂：于500 ml锥形瓶内加入碘化钾150 g，碘110 g，汞150 g及蒸馏水100 ml。用力振荡7～15 min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000 ml量筒内，加蒸馏水至2000 ml，混匀备用。
 

4.  20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
 

5.  1.5cmx20 cm层析柱。
 

6.  黑、白比色磁盘。
 

二、操作
 

1.  取层析柱1支（1.5 cmx20 cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17 cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175 mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
 

2.  凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5 ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。
 

3.  在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。
 

4.  由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为"脱盐”后的IgG。
 

注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。

在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。