蛋白质的分离纯化（一）

　　蛋白质的分离纯化是生物化学技术中的重要内容，在科研和生产中都有重要作用。蛋白质纯化的流程大致包括选材及预处理、细胞破碎及抽提、初步提取和精制纯化等部分，根据具体的纯化目的和要求可以有所不同。

　　选材的主要原则是原料易得，蛋白含量高，最好便于纯化。蛋白质的主要来源包括动物、植物和微生物。由于种属差异及培养条件和时间的差别，其蛋白含量可相差很大，提取难度也完全不同。

　　一般植物细胞含纤维素，坚韧，不易破碎，且多含酚类物质，易氧化产生有色物质，难以除去。其液泡中又常含有酸性代谢物，会改变溶液的pH。微生物因为容易培养而较为常用，但也需要破碎细胞壁。动物细胞没有细胞壁，相对容易处理，但往往成本较高。

　　选定材料之后，一般都需要进行简单的预处理，快速去除不需要的部分，以利于蛋白质的提取操作。常见的预处理包括植物种子去壳、脱脂，叶片清洗、去除干枯坏死组织；动物组织清洗血污，去除皮毛、脂肪、神经、血管；微生物发酵液细胞分离和絮凝等。

　　如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组织分散机、超声波、丙酮干粉等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。

　　如果目的蛋白定位在细胞核或某个细胞器中，一般还要通过差速离心等方法分离细胞核或相应细胞器。这样可以减少很多杂蛋白，有助于后续纯化。

　　在细胞破碎时一般会加入缓冲液进行抽提，将目的蛋白溶出，同时保持合适的pH和离子强度。一般可溶蛋白用稀盐提取，脂蛋白可用稀SDS或有机溶剂抽提，不溶蛋白用稀碱处理。

　　抽提时要提高蛋白浓度可以采用少量多次的方法。要防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和。为防止酚类氧化可加5 mM维生素C。要防止蛋白降解可以加入各种蛋白酶抑制剂。现在有商业化的由多种蛋白酶抑制剂组合成的混合抑制剂，实验室中一般称为“cocktail”，使用很方便。如果进行磷酸化等蛋白质修饰研究，也要加相应的磷酸酶抑制剂等。