蛋白质制备过程中如何保持蛋白活性？

蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。高分子蛋白质具有一定的立体构象，相当不稳定，极易变性、变构，为得到天然状态的蛋白质，尽量采用温和的手段，如中性、低温、避免起泡等，还要注意防腐。

动物材料中的蛋白质有些可溶的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。

整个制备过程一般可分为5 个阶段：①材料的选择和预处理，②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离），③提取，④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等），⑤浓缩、干燥及保存。以上5 个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。

不论是哪一阶段使用哪一种方法，均必须在操作中保持生物大分子结构的完整性。保存活性，防止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失。（以上资料来自中国生命科学论坛）

细胞破碎方法有多种，比如机械法（如组织捣碎匀浆机、玻璃匀浆器）、物理法（反复冻融法、冷热交替法、超声波法、高压破碎），化学及生物化学法（加入有机溶剂、溶解酶或裂解酶、表面活性剂）等。

玻璃匀浆器

高压细胞破碎法是一种物理破碎方法，避免了化学法和酶法等导致的化学物残留和污染等问题。超声破碎法可能出现的起泡现象在高压破碎时是不会出现的。

样品经适当预处理，再配合使用低温超高压连续流细胞破碎仪，提取到的蛋白质活性好。（参考文献：氯氟氰菊酯对德国小蠊保护酶活性的影响，中国媒介生物学及控制杂志，2009，20（4）：303-306）。这是因为在细胞破碎过程中，低温超高压连续流细胞破碎仪提供周密的保护，最大限度地保持蛋白质活性，具体表现在：

① 独创的冲洗系统及进口镜面抛光316L不锈钢管道，防止样品残留，保证管道清洁，排除酸碱干扰。 316L不锈钢管道

② 进样、破碎、出样全过程可在4~6℃低温循环水浴中进行，避免高温导致的蛋白质失活。

③ 破碎压力0~207Mpa连续可调，便于摸索最佳破碎条件，保证温和破碎。