蛋白质合成实验

实验步骤

材料

无菌

细胞培养，如 1X10⁴～ 1X10⁶ 个细胞，24 孔板
³H-亮氨酸。无血淸培养基中 2 MBq /ml (～50uCi/ml) (特异活性并不重要，因为它将由培养基中的亮氨酸浓度决定）

非无菌

SLS 或 SDS，1% (35m mol/L ) 溶于 0 .3 mol/L NaOH
三氯醋酸（TCA)
液闪瓶
Eppendorf 管
闪烁液，最小含水为 10%

操作步骤

1. 细胞生长至所需密度。

2. 从孵箱中取出培养板，加人预温的溶于培养液或 BSS 中的放射性同位素，稀释度为 1:10 (如 l00ul/ml/孔）。

3. 尽快地将细胞放回孵箱。

4 . 继续培养 4～24 h。

提示： 不同的蛋白质更新率不尽相同。本操作程序并不针对任何特定的一种蛋白质，而可用于快速生长细胞中的总蛋白。当第一次用来测定一个细胞系的蛋白质合成时，要核实合成率在所选的孵育时间内是否呈线性。如果氨基酸池比饱和时低，可发生延迟。

5 . 从孵箱中取出培养物，小心从孔中吸去培养液至适当的废弃放射性液体容器中（见 7.7.2 节）。
1. 用冷 HBSS 或 D-PBSA 轻轻地清洗细胞。

提示 某些单层培养，特别是一些松散贴附的连续细胞系，诸如 HeLa-S , 可能在清洗时便离散开来。如遇这种情况，移去同位素，并加入甲醇，将单层固定，静止 lO min，小心地移走甲醇，令其晾干。

7．将培养板置于冰上，加人 0.6mol/L TCA ，于 4°C 静置 lO min ，：然后吸去所有未掺入的前体物。

8. 重复第七步 2 次，但每次只许 5 min 。

9 . 以 MeOH 清洗培养物，晾干培养板。

10．加人 0.5 ml 0.3mol/L NaOH ，内含 1% SLS，室温下静置 30 min 。

11. 混合每孔中的培养物，将它们移人液闪瓶中。

12. 加入 5m l 闪烁液，在闪烁仪中计数。

提示： 生物降解性闪烁剂（如 Ecoscint)，比以甲苯或二甲苯为基础的闪烁液更好，因为只要是放射活性低于规定量，前者毒性较小，可以与大量的水一起倒入水池 中。对于悬浮培养的细胞，在第 5 步用 1000 g 离心 l0 min ，去除培养基，除了第 9 步外 6，7 ，8 也须重复此步骤，第 9 步的培养板也可在磷光成像仪（phosphorimager) 上直接定量测定。                                                                  

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