蛋白质回收实验

蛋白质

SDS DTT 脱色液 染色液

电泳仪 透析膜

1.  凝胶浸泡在染色液中于室温缓慢摇动染色15~20 min，然后移至脱色液中于4℃温和摇动下脱色2~3 h。

2.  切下染色后的凝胶条带，于4℃水中浸泡2~3 h，期间换几次水。然后分别将每条胶移入Petri培养皿中，加入10 ml 水覆盖之，并将它们捣碎成约1 mm³的碎片，再用巴斯德吸管将水吸千。

3.  用一园片状的Spectrapor 6透析膜将电洗脱仪的洗脱池的底端盖好，并拧紧帽子
 

图一、洗脱池

4.  将捣碎的凝胶移入洗脱室的粗大的一端，并以浸泡缓冲液覆盖，在浸泡液之上，加入一层冼脱液，使之刚没过水平隧道，排除气泡。

5.  将洗脱室置于洗脱池之内，加入洗脱液至仅高于各电极槽的排液出口， 将其余的液体加入小混合池中。

6.  连接双通道蠕动泵，调整流速使溶液能缓馒地从混合池中滴回洗脱池。用弯头巴斯德吸管吸去洗脱室透析膜下的所有气泡，小心不要戳穿透析膜。

7.  将凝胶碎片浸泡3~5 h。连接电极，注意将阴极连接于冼脱室有凝胶碎片的一侧。50 V 恒压12~16 h。

8.  关电源，撤去与电极的连接，以透析液代替洗脱罐中的冼脱液。重新连接电极，在80 V 恒压下12〜24、

9.  关电源，撤去与电极的连接，关闭蠕动泵。从罐中取出洗脱室，吸去含洗脱蛋白的收集池中蓝色蛋白层上面的缓冲液，以带平嘴针头的50 μl 注射器混匀剩余的含蛋白液体。

10.  将蛋白溶液移入一微量离心管中，用50 μl 透析液洗收集池，并合并于蛋白液。

11.  在Speedvac蒸发器中冻干液体，样品可在-20℃保存。
 

图二、洗脱仪及洗脱池

12.  样品用100 μl 水重溶，并以50：50甲醇/丙酮沉淀。-20℃过夜，微量离心沉淀蛋白。

13.  取5%~10%样品用Laemmli凝胶系统的微型胶分折蛋白冼脱的程度、分子量和回收率，蛋白质可用考马斯亮蓝或银染法检测。

14.  将剩余的样品加样于浏序滤膜，用于蛋白质序列分析。