蛋白质在哺乳动物细胞中表达实验

载体（如 CDM 8）

1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组 DNA 。用小量法（5 ml 培养液）或用 CsCl／溴化乙锭离心法纯化重组 DNA。

2. 在转染的前一天，将 COS-7 细胞以约 20% 汇片的数量种入含 DMEM-2 CS 培养基的 100 mm 培养皿（这样在第二天细胞可长至约 50% 汇片）。让细胞生长过夜至约50% 汇片。

3. 使用前（对每一个待转染的 100 mm 培养皿中的 COS 细胞），将 5 ml 37℃ 的 DMEM-2 NS 培养液与 0.2 ml DEAE-葡聚糖/氯喹溶液彻底混匀，再加入 5~10 重组 DNA 混匀。

4. 吸出 COS 细胞的培养液，向每一个 100 mm 培养皿加入步骤 3 制备的 DMEM-2 CS／DEAE-葡聚糖／DNA。温育细胞 3~4 h。用差相显微镜观察细胞。

DEAE-葡聚糖将引起细胞收缩并变得空泡化。长时间的孵育可提高转染效率，而另一方面也会使细胞死亡。

5. 吸出 DMEM／DEAE-葡聚糖／DNA，加入 5 ml 10% DMSO (用 PBS 配制）。室温温育细胞 2 min。

6. 吸出 DMSO 并加入 10 ml DMEM-2 CS。让细胞生长过夜（12~20 h）。如果过夜培养后有大量细胞浮起，则需重新开始，但在第二步时细胞应多长一天。

7. 将每个 100 mm 培养皿中转染的 COS 细胞传代至两个新的 100 mm 培养皿。

转染后，COS 细胞生长不好，第二天传代有助于恢复生长，提高蛋白质表达水平。此外，DEAE-葡聚糖处理后的细胞变黏，第二天传代可恢复细胞贴壁的特点，这样用 PBS 和 EDTA 轻柔处理后，细胞可能会再次浮起。

8.1 当表达分泌蛋白时，

在完成步骤 7 后 96 h，加入 5 ml DMEM-2 CS 并培养 4 天。收获培养液，室温下以约 1000 g 离心 10 min，除去死细胞和碎片，保留上清液。用生物学鉴定或代谢标记和免疫沉淀、免疫亲和层析、放射免疫或免疫印迹来检测分泌蛋白。

8.2 当表达细胞表面蛋白或细胞内蛋白时，

按步骤 6 转染后 72 h，从细胞中吸出培养液。加入 5 ml PBS，摇晃洗涤，吸出 PBS。加入 5 ml 溶于 PBS 中的 0.5 mmol/L EDTA，温育 15 min。用巴斯德吸管轻轻移出培养皿中的细胞。采用合适的荧光抗体使细胞表面蛋白染色，通过显微镜或流式细胞仪检测。

除非特别说明，所有的细胞均需在 37℃、6% CO₂ 加湿培养箱中培养。