蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南（三）

蛋白质纯化

RP-HPLC 是一种有效的蛋白质/多肽纯化工具。

通过 RP-HPLC 法可以从杂质中分离目标蛋白/多肽，采集到的片段可用于进一步研究，以及借助正交分析技术的分析，甚至可作为治疗药物。

在蛋白质/多肽分析过程中，色谱条件优化的目标是优化分辨率和保留时间。

制备色谱法分离蛋白质/多肽时，色谱条件的开发主要是三个参数的优化（参见图45）：

• 产量是从色谱法每一步中得到的纯化的目标蛋白/多肽含量。高产量可提高纯化过程的实用性，并降低成本。

• 纯度是从目标产物中去除杂质的程度。纯度高有助于从后续分析中获得更佳的数据或获得高纯度产物。

• 通量用来衡量制备周期中纯化的物质量。高通量说明在给定的成本和时间内获得更多研究或分析用物质，或更多原料药，用于制药领域。

由于制备色谱的目的与分析色谱的目的不同，因此色谱条件优化也不同。

图45. 在蛋白质或多肽的制备纯化中，通过寻求产量、纯度及通量的最佳平衡实现分离条件的优化。

样品装载

在分析色谱中，将小样品装载到色谱柱上以确保加样量不影响分辨率。

如果样品量过高，则峰会加宽，进而分辨率会下降。

在不发生峰展宽的情况下允许加载到色谱柱的样品量（“样品容量”）取决于柱的大小（附录列表显示了柱的大小和样品容量）。

制备色谱法纯化蛋白质/多肽时，通常会超出样品容量，使柱“过载”，从而增加产量和通量（图46）。

当允许一定的分辨率损失时，加载的样品量可为样品容量的10~50倍（附录，最大实际负载）。

图46中，尽管由于柱过载使得峰变宽，但峰形相对较好，说明严重过载在增加产量的同时还能保持纯度，但目标蛋白/多肽的损失不可避免。

由于样品过载，图47中峰也同样加宽。

片段收集、分析和利用

当柱过载时，通常会抛弃起始峰和结尾峰。

图46中，对红色区标示的峰的中间区域进行了收集。去掉了峰首和峰尾。

这避免了分离度较差的杂质峰的收集，增加了纯度，但降低了产量。

在制备色谱中，对几种感兴趣的峰进行了片段收集，用于杂质分析。  

图46.在多肽纯化示例中，制备分离包括柱的过载加样，以增加产量。

分辨率降低，为了增加纯度必须抛弃峰首和峰尾，但产量稍微有所降低。

基于分析结果，收集了少杂质或无杂质的片段，抛弃了峰首和峰尾附近杂质较多的片段。

收集和抛弃片段的选择应考虑纯度和产量的平衡。

例如，在不损失分辨率的情况下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于纯化少量多肽（最多约200微克）。

但为了增加产量和通量，同样大小的柱最多可纯化10毫克，但会有一定的纯度或产量损失。

恰当的收集峰选择有助于实现纯度和产量间的最佳平衡。

在制备色谱中，尽管重点在样品质量，但样品体积也可能会很大。

尽管可采用样品环和注射器，但通过将样品“泵”至柱上可以注入更多样品。

将泵的吸入管置于样品容器内，样品通过洗脱泵加载至色谱柱。

当有机溶剂浓度低（通常，样品装在水相中）且目的蛋白/多肽以有机溶剂梯度洗脱时，可通过这种方式装入大量样品。

吸附剂粒径

分析色谱常用的吸附剂粒径为5μm，制备色谱常用的吸附剂粒径更大。

尤其是加样量超过样品容量时（柱过载），柱效较分析色谱影响较小。

当柱过载时，大粒径填充柱同小粒径填充柱分离蛋白质和多肽的效果一样。

因此，制备色谱常用10μm或以上粒径的吸附剂。粒径分布也往往更宽。

不同于0.5μm或更窄的粒径分布范围，制备色谱的粒径范围更大，例如10~15μm。

由于制备色谱柱反压和成本更低，因此更倾向于采用大粒子。