蛋白质定量／蛋白质含量的测定(LOWRY法)

实验概要

运用LOWRY法测定蛋白质的含量。

实验原理

Lowry法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，再加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowry法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3～15倍，为双缩脲法100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。
 

Lowry法的试剂由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜溶液），可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，因此蛋白质的酪氨酸和胱氨酸等可显色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

主要试剂

Na₂WO₄•2H₂O；Na₂MoO₄•2H₂O；85% H₃PO₄；浓HCl；Li₂SO₄•H₂O；溴水；酚酞指示剂；Na₂CO₃；NaOH；CuSO₄•5H₂O；酒石酸钾钠；
 

牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。

主要设备

试管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管一套（带橡胶管）；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl；分光光度计。

实验材料

可溶性蛋白质

实验步骤

1. 酚试剂的制备

  （1）取Na₂WO₄•2H₂O 100g，Na₂MoO₄•2H₂O 25g 及蒸馏水700ml于1500ml的圆底烧瓶中，之后加入85% H₃PO₄ 50ml，浓HCl 100ml。安上回流冷却装置（使用磨口接头。用软木塞或橡皮塞时，必须用锡泊包起来），使其慢慢沸腾10h。冷却后加入Li₂SO₄•H₂O 150g，水50ml，浓HCl 100ml安上回流冷却装置，开口加热煮沸15min，以逐出过量的溴。冷却后稀释至100ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存。

    使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞为指示剂。滴定终点由蓝变灰。滴定后算出酸浓度，用时适量稀释，使最后浓度为1mol/L H＋，此为Folin-酚试剂乙液。
 

  （2）首先配制①4% Na₂CO₃溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO₄溶液；④2%酒后石酸钾钠溶液；使用前①与②等体积混合配成Na₂CO₃-NaOH溶液；将③与④等体积混合配成硫酸铜一酒石酸钾钠溶液。然后将这两个溶液按50︰1混合；配成Folin-酚试剂甲液。此试剂只能用一天。
 

2. 标准曲线的绘制

  （1）取7只试管编号,分别加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml标准蛋白质溶液，用水补到1ml，便成为每管含蛋白为0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg标准系列（必要时可做重复）。

  （2）加5ml试剂甲，混匀，于30℃放置10min。

  （3）喷射加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。

  （4）准确到30分后，以不加标准蛋白的管为空白，在500nm波长下比色测定吸光度值。

  （5）以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
 

3. 样品测定

  （1）取50μl样液加入试管中，（样液提取一般按0.1g鲜样/ml比例，提取方法见各酶活测定）加蒸馏水补至1ml，然后重复步骤2的（2），（3），（4），以空白为参比，测吸光度值。

  （2）根据吸光度值，查标准曲线求得蛋白质含量。
 
4. 结果计算

蛋白质含量（mg/g鲜重）＝ (C*V/a)/W 
 

式中  C－查标准曲线得样品测定管中蛋白质含量（mg）；

V－提取液总量（ml）；

a－测定时取样液量（ml）；

W－取样量（g）。

注意事项

1. Folin试剂乙只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。
2. 为了保证反应进行完全，反应在25～30℃水浴中进行，反应30min后准时比色。
3. 还原物质干扰本实验。

 
考马斯亮蓝法和LOWRY法两种方法均是灵敏度为微克级的高灵敏度定量测定蛋白质方法，前者稳定，后者简便；二者均优于现有的其它方法。
二者的缺点是：
1. Lowry法受植物体内存在的酚类物质干扰；
2. 考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。