蛋白质的微量测序分析实验

蛋白质

凝胶缓冲液 谷胱甘肽 疏基乙酸 考马斯亮蓝

电泳仪 微量注射器

1.  制备分离胶和积层胶溶液灌制变性微型凝胶。

2.  组装垂直凝胶电泳装置。

3.  将80 ml 4×凝胶缓冲液稀释至320 ml。将200 ml 1×凝胶缓冲 液倒入下层缓冲液槽。

4.  剩余的1×凝胶缓冲液加入还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度1 mmol/l，将它们倒入上层缓冲液贮槽。将凝胶连接于恒压/恒流电源。

5.  10 mA 下预电泳45 min。

6.  关闭电源，将凝胶放置过夜。

7.  倾出凝胶缓冲液，用纸巾或滤纸吸干加样孔。

8.  将10×上槽和下槽缓冲液稀释至1×往下槽倒入200 ml 下槽缓冲液，150 ml上槽缓冲液加入0.1 g 巯基乙酸（钠盐）后，倒入上槽。

9.  用微量注射器或凝胶加样吸头将溶于凝胶缓冲液的蛋白质样品加入凝胶的加样孔。

10.  在10 mA 下电泳至粉红色的示踪染料达到凝胶的底部，关闭电源。

11.  用甲醇润湿2张PVDF膜，然后浸没在转移缓冲液中。

12.  拆卸凝胶夹层，轻轻将玻璃板分开。

13.  按下面的次序在小型转移装置中组装转印夹层：塑料框、海绵、滤纸、凝胶、2张PVDF膜、滤纸、海绵、塑料框。

14.  将转印夹层插入转移装置，最靠近阳极（红色或正极）的是膜。用转移缓冲液充满装置。

15.  在转移装置电极间的电压降为6 V/cm 的条件下，转移时间因目标蛋白和凝胶的浓度而异。

16.  拆卸转印装置，取出PVDF膜，将它浸没于含0.1%考马斯亮蓝的50%甲醇中，摇动 5 min。

17.  用含10%乙酸的50%甲醇脱色，摇动至条带变得清晰可见。

18.  转印膜移入水中，拍照。

19.  用刀片将目标蛋內的条带切下（每条带均用新的刀片），将每一条带放入微量离心管中，室温风干（不要加热），切下的条带贮存于- 20℃

20.  将切下的条带放入测序仪的反应室，蛋白面朝向溶剂液流。

21.  在自动化测序仪中测序。