蛋白质的抽提实验

转型菌株pQG11 M15 [pREP] 单一菌落

LB amp kan液体培养基 IPTG Na3PO4·12H2O NaCl EDTA Triton X-100 液氮

恒温震荡培养箱 高速冷冻离心机 离心管 冰筒

1.  挑取培养皿上单一菌落，培养在15 mL 的LB/amp/kan 液体培养基中，以120 rpm 转速震荡，在37℃下培养过夜。 

2.  取上述菌液6 mL加入300 mL新鲜LB/amp/kan培养基中，以120 rpm 37℃培养至A₆₀₀ = 0.6 后，加入IPTG成为1 mM浓度，继续以120 rpm在37℃震荡培养4 h。
 

3.  将菌液倒入50 mL 离心管 （conical tube） 中离心10 min （5 000 rpm）。
 

4.  倒去上清，可将菌块连同离心管置 -20℃冰箱贮存。
 

5.  取出含菌块的离心管置碎冰上，待菌块溶解后，以残存液体均匀悬浊的。再加入10 mL lysis buffer 轻轻悬浮的。
 

6.  将菌液放在液态氮中冷冻1 min,然后在37℃水浴中摇荡溶解的。如此反复三次，尽量不要产生大量气泡。将离心管的内容物倒入50 mL 高速离心机的离心管内。
 

7.  离心20 min （12 000 rpm，4℃） 取上清共 _____ mL，称为 粗抽取液 （XT）；预留100 μL 以便日后一起进行分析。此后样本均得放置碎冰上，以低温进行实验。
 

8.   此上清加入5 mL buffer A-0 混匀后倒入烧杯，置碎冰上放冷，不时搅拌并缓缓加入固体硫酸铵 _____ gm,使成为70%饱和度，加完后再搅拌10 min。
 

9.  离心20 min （12 000 rpm，4℃） 后小心倒去上清，取白色沉淀部份。
 

10.  沉淀加以2 mL buffer A-150 均匀悬浊的，再以桌上型离心机去除不溶物质，（10 000 rpm，5 min），共得 ______ mL，称为 全蛋白质 （TP）；预留100 uL,连同上述XT 置4℃冷藏。
 

11.  其余溶液部份准备进行胶体过滤层析，标示清楚后置4℃冷藏。

1. 操作时总是小体积小量的操作，避免污染，并且动作要快。

2. 蛋白酶普遍存在，在提取蛋白质的步骤中，早些抑制，经常抑制。

3. 分装蛋白溶液，储存于不同的温度和不同的缓冲液中，测蛋白活性，找出最适储存条件。

4. 冷藏，并加入稳定剂。这些稳定剂一般都能充分保持蛋白的生物学活性。

5. 避免酶的反复冻融，如果酶需要冻存，分装成小管后冻存。

1、仪器用具

恒温震荡培养箱37℃；高速冷冻离心机及离心管 （使用20,000 rpm离心陀）使用高速离心机要注意： 离心机及离心陀的温度要预冷完全，相对位置的两只离心管要平衡好，离心陀转速绝对不能超过最高速限；液态氮及冰筒；37℃温水浴。
 

2、药品试剂

转型菌株pQG11/M15 [pREP] 单一菌落；LB/amp/kan 及IPTG （1 M stock）；Lysis buffer （50 mM Na₃PO₄·12H₂O， pH7.0； 0.1 M NaCl；0.1 mM EDTA； 0.2%Triton X-100）使用前添加成10 mM

β-mercaptoethanol，25 ug/mL PMSF，40 ug/mL lysozyme.Buffer A-0 （50 mM Na₃PO₄， pH7.0） 使用前每1 L 添加70 μL β-mercaptoethanol 成为10 mM 最终浓度。Buffer A-150: Buffer A-0 再加有0.15 M NaCl；硫酸铵（要烘干并以研砵磨碎）。

3、蛋白质的储存： 

（1）蛋白样品在液氮中速冻，拿出后加入10-20%的甘油，长期储存。

（2）整个实验过程中，都要将蛋白样品置于冰上。

（3）从母管中吸取不同的蛋白时，都要用新鲜的枪头。

（4）不要将未用的溶液倒回母管。

（5）戴手套操作，避免蛋白交叉污染，或是蛋白酶的污染。

（6）避免剧烈的震荡，避免溶液中混入蛋白变性剂。

（7）实验的过程中应避免灰尘进入，灰尘包含60%的肌氨酸。