蛋白质浓度分析实验

标准蛋白质

BSA

干燥试管

一、标准 Bradford 分析

1. 准备 3 份标准品（用水稀释），BSA 浓度为 0.2~0.9 mg/ml，IgG 浓度为 0.2~1.5 mg/ml。一般设定 4 个或 5 个浓度比较合适。如果样品中蛋白质浓度可能超过分析范围，那么应用样品缓冲液相应稀释。分析的样品至少为双份。

标准蛋白质：使用纯化蛋白质作为相对标准；BSA 或 lgG 试剂盒能够买到（如从 Bio-Rad )。用去离子水制备浓度为 2 mg/ml。

Bio-Rad 蛋白质分析缓冲液或染色剂（包括乙醇、磷酸和考马斯亮蓝 G250 )：使用浓缩的或者将 1 份稀释到 4 份去离子水中并通过 Whatman #1 滤纸过滤（在 4℃ 可保存 2 周）。

2. 分別吸取样品和标准品各 100 μl 置入干净的干燥试管中（10 ml 或更大）。加 5.0 ml 稀释过的染色剂到各试管中。摇匀后于室温放置至少 5 分钟。

准备一个空白对照，其中加 100 μl 用以制备裂解液或稀释（裂解缓冲液中）标准品的缓冲液。

在混匀后 1 小时内（最好在混匀后 10 分钟）在 595 nm 处读取吸收值，如果可能， 可用一次性的塑料杯。

3. 将每个标准浓度得到的 A₅₉₅ 吸收值加以平均，减去空白的吸收值，然后绘制吸收曲线再对样品的吸收值进行平均，减去空白对照值，从吸收曲线上推算出样品的浓度。

二、Bradford 微量分析

1. 按上述步骤 1 制备标准品，标准蛋白使用范围为 BSA 1.2~10.0 μg/ml，IgG 为 1.2~25.0 μg/ml。

2. 吸取 800 μl 样品或标准物质置干净的干燥试管中。每个试管加 200 μl 未稀释的染色剂，如上所述方法摇匀后罝于室温下。

3. 混匀后 1 小时内读取 595 nm 处的吸收值按上述步骤 3 估算蛋白质浓度。