蛋白质浓度测定（双缩脲法）实验

实验原理

测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有凯氏定氮法；比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法；紫外分光光度法等

双缩脲(Biuret)法：在碱性溶液中，双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO—NH2)，或与此相似的基团[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。

实验试剂

1．6mol/L氢氧化钠溶液  
称取氢氧化钠(NaOH，优级纯)240g，用新鲜蒸馏水配制成1L，置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。
2．双缩脲试剂  
称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠(NaKC₄H₄O₆.4H₂O)9.0g，碘化钾(KI)5.0g，待安全
溶解后，加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。
3．蛋白标准液 
可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清，用凯氏定氮法标定后，加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓0.5~1.0g/L)，冰冻
保存。

实验设备

恒温水浴箱、722（721）分光光度计、吸管、试管、坐标纸

实验步骤

1. 配制20g／L蛋白标准液  如蛋白标准液浓度为70g／L，则取此液2m1，加入新鲜蒸馏水5ml，混匀即成。

2. 按表操作

混匀，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用540nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

3. 标准曲线绘制
1—5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。

4. 实验结果
根据测定管吸光度，从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。

注意事项

1．双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2 形成稳定的络合铜离子，以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比不低于3：1，加入KI作为抗氧化试剂。

2．双缩脲试剂要封闭贮存．防止吸收空气中的二氧化碳。

3．本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。

4．黄疸血清．严重溶血对本法有明显干扰。

5．本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线，在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。