蛋白质的生物合成标记实验

蛋白质

甲硫氨酸 PBS

培养箱 离心管

1.  培养悬浮细胞至对数增长期，室温300 g 离心5 min。回收10⁷~10⁸细胞。

2.  每2×10⁷细胞用约10 ml 37℃的短时间标记培养基在圆锥型试管中洗涤，于室温300 g 离心5 min 回收细胞，小心重悬细胞并重复洗涤过程。

3.  以37℃的短时间标记培养基重悬至5×10⁶细胞/ml，于37℃保温15 min 以耗尽细胞内的甲硫氮酸，间歇摇动。

4.  室温解冻［³⁵S］甲硫氨酸，并用37℃短时间标记培养基来配制含0.1~0.2 mCi/ml 的工作液。

5.  室温300 g 离心5 min，回收细胞，每2×10⁷细胞以4 ml［³⁵S］工作液重悬于圆锥试管。37℃水浴保温30 min~3 h，频繁翻覆试管以混悬细胞。

6.  4℃ 300 g 离心回收细胞，小心重悬于10 min 冰冷PBS缓冲液，重复离心操作。

7.  必要时，用TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量，按免疫亲和层析、免疫沉淀法和单向和双向凝胶电泳处理和分析细胞。

1.  在标记过程，会释放挥发性的［³⁵S］化合物，在使用前须把过于37℃水浴的［³⁵S］甲硫氨酸紧紧密封，不要在37℃放置超过30 min。

2.  培养液和冼涤液具放射性，须遵循放射性物质的使用和丢弃的安全守则进行。