很多膜可作为蛋白质电转移的固相支持物,如重氮化纤维素膜(DPT,DBM)、DEAE-纤维素膜、尼龙膜等,但用的最多的还是硝酸纤维素膜(NC膜),该膜与蛋白质以非共价的疏水作用形式结合,结合能力约为80 μg/cm2。
实验方法
基本方案
实验材料 蛋白质
试剂、试剂盒 转移缓冲液 甲醇 电极缓冲液
仪器、耗材 电转移槽 电泳仪
实验步骤
1. 剪6块3 MM 滤纸和一块NC膜。
2. 将剪好的3 MM 滤纸和NC膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟。
3. 按下列过程安装转移装置,将塑料支架平放在含转移缓冲液的托盘中,在塑料支架上放一块海绵。
4. 将3块3MM滤纸对齐放在海绵上,然后依次将NC膜、凝胶、及另3块虑纸和海绵放上。
5. 用塑料支架夹紧上述各层,放入电转移槽内,NC膜一侧向正极,凝胶一面向负极。
6. 接通电源电压120 mA,转移6小时以上或过夜。
7. 转移结束后,取出塑料支架,依次取掉各层,用铅笔在膜的上沿作好标记,切下其中一个孔所对应膜的一半,用氨基黑或考马士亮兰染色,检查转移效果。
8. 将其余的NC膜放在一张干净的3 MM 滤纸上,室温干燥30~60分钟(可不做)。
注意事项
1. 虑纸及膜的大小不应大于待转移胶的大小,否则在转移过程中会发生短路,影响转移效果。
2. 操作中应戴手套,切不可用手直接触摸,因手上的汗和分泌物将直接影响到蛋白从胶向膜的转移。
3. 放置NC膜和滤纸时,每层之间不应有气泡,否则将影响转移效果。
4. 待转移蛋白分子量决定转移时间,分子量大,转移时间长,反之则小。
5. 干燥虽然可使蛋白质更牢固地结合到膜上,但也可能加剧蛋白
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