蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐实验

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体, 在高浓度的中性盐影响下脱去水化层, 同时, 蛋白质分子所带的电荷被中和, 结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解, 故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白) 比分子量小的( 如白蛋白) 易于析出。改变盐浓度, 使不同分子量的蛋白质分别析出。
 

含盐蛋白质溶液流经凝胶层析柱时, 小分子量的盐分子因进入凝胶颗粒的微孔中, 所以向下移动的速度较慢; 而大分子的蛋白质不能进入凝胶颗粒的微孔, 以较快的速度流过凝胶柱, 从而使蛋白质与盐分开。
 

蛋白质分子中具有芳香族氨基酸残基, 因此, 对280 nm 的紫外光有最大吸收, 且成正比, 符合Beer 定律。将分步收集的样品液于紫外分光光度计检测, 收集蛋白质样品。

蛋清 血清

饱和硫酸铵溶液 硫酸铵 葡聚糖凝胶SephadexG-25

试管 三角漏斗 玻棒 滤纸 试管架 752 型紫外分光光度计 石英比色皿 玻璃层析柱 乳胶管 止水夹

1.  卵清蛋白的分离
 

(1)取卵清约2 ml 于试管中, 加等体积的饱和硫酸铵溶液,搅拌均匀, 蛋白质析出, 静置, 用滤纸过滤致滤液澄清, 沉淀即为卵球蛋白, 将此沉淀用2 ml 半饱和硫酸铵洗涤一次。

(2)将析出卵清球蛋白后的滤液放入试管中, 再加入固体硫酸铵使之达饱和, 观察有无沉淀产生, 若有沉淀, 则过滤之。滤出的沉淀即为卵清白蛋白。

2.  脱盐

(1)凝胶柱的准备: 称取葡聚糖凝胶sephadexG-25 5 g , 加入80 ml 洗脱液(蒸馏水) , 在沸水浴中溶涨30 min , 用倾泻法倾去悬浮的小颗粒。然后装进内径1 . 2 cm, 高30 cm 的玻璃层析柱内。注意装填均匀, 无气泡和裂纹存在, 并保持液面在凝胶床表面以上。

(2)加样与洗脱: 打开柱的出口, 让柱内液体慢慢流出, 直至液面与凝胶床表面相平。然后加入2 ml 含盐蛋白质溶液, 至样品液面刚好到达凝胶床表面时, 渐渐加入30 ml 洗脱液, 以0 . 5～1 ml/ min 的流速洗脱, 每5 ml 装试管分步收集。

(3)收集液的蛋白质含量可用280 nm 处的紫外光吸收法等检测。盐类可用离子呈色等方法鉴定。
 

(4)画出蛋白质280 nm 吸收曲线图, 将蛋白质溶液收集待用。
 

1.  上述操作中加入固体硫酸铵的量可参看附录计算后加入。

2.  装柱加入凝胶时凝胶高度要达25 cm 高度左右, 否则由于容量小脱盐情况不好。

3.  测量后的样品不要倒掉, 收集蛋白质含量高的样品封口后于冰箱保存。

4.  使用过一次的凝胶柱, 进行平衡后可再次使用。但使用过多次的应进行再生处理( 低浓度碱浸泡30 min , 用水洗至中性, 低浓度酸浸泡30 min , 用水洗至中性, 装柱使用, 或加防腐剂于冰箱保存。