蛋白质糖基化的检测

试剂、试剂盒 磷酸钠缓冲液蛋白溶液β-巯基乙醇NP-40 溶液

仪器、耗材 SDS-PAGE

实验步骤

一、用 PNGaseF（N-多糖酶）处理

1. 以 0.1 mol/L 磷酸钠（或 Tris-HCl，而不用柠檬酸）缓冲液，pH 7.4 ( 7.0~8.0 ) 配制高达 2 mg/ml 的蛋白溶液，并含 50 mmol/L β-巯基乙醇和 0.1% SDS，在水浴中煮沸 2 分钟。

2. 加 1/10 体积的 10% NP-40 溶液（或使 SDS 浓度少于或等于 0.17%，NP-40：SDS 的质量比在终反应中至少是 7:1)。

3. 加 PNGaseF 到终浓度为 6 mU/ml。注意这里的 1U 相当于在 1 分钟形成的 1 微摩尔产物；--些厂家用 1U = 1 nmole/分 在 37℃ 中保温 16 小时，以完全脱糖基化。

4. 用 TCA/DOC 按照下列步骤沉淀以制备 SDS-PAGE 样品。

(1) 在样品中加等体积的含 50% TCA 的 10 mmol/L DOC 溶液，并且在冰上放置 20 分钟。

(2) 以最大速度（16000 g)，4℃ 下离心样品 15 分钟。

(3) 用冷丙酮清洗沉淀一次，并再次离心样品。

(4) 用 SDS-PAGE 样本缓冲液重悬最后的沉淀，如有必要，可用小体积的 1 mol/L Tris pH 8.0。将悬液调至 pH 8.0 样品上样至凝胶上进行电泳。

二、用 EndoH 处理

1. 在 100 mmol/L、pH 5.5 的柠檬酸钠缓冲液中制备浓度达到 1 mg/ml 的蛋白样品。

2. 用 10 mU/ml 酶 37℃ 消化样品过夜。

3. 按常规的方法处理样品用于 SDS-PAGE 分析。

三、酶去除 O- 多糖

1. 二甲胂酸钠（磷酸盐或马来酸盐，但不是 Tris-HCl ) 中制备浓度 5 mg/ml 的蛋白，pH 6~7.6。

2. 用 10 mU/ml 的酶消化样品，在 37℃ 孵育过夜。

3. 按照 PNGaseF 第 4 步所述的方法（TCA/DOC 沉淀）处理反应混合物以进行 SDS-PAGE。

四、来自产脲节杆菌的唾液酸苷酶

1. 以 pH 5.0、50 mmol/L 醋酸钠制备 0.5 mg/ml 的蛋白溶液。

2. 加 10 mU/ml 的唾液酸苷酶，37℃ 下保温 12~16 小时。

3. 制备样品用于 SDS-PAGE 分析。