胶体过滤法
实验材料 | Sephacryl S-300胶体 |
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试剂、试剂盒 | 缓冲液buffer A-150 |
仪器、耗材 | 色析管柱 铁夹 试管 铁架 水平仪 收集器 浓缩用离心机 浓缩用离心管 |
实验步骤 |
一、仪器设备 二、药品试剂 三、管柱装填 1.
以纯水冲洗玻璃管柱
(以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);并请了解管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接部分收集器,并以bufferA-150
试看管路是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当,不要装置于交通要冲。 2. 依预估量取出Sephacryl 胶体,注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡;将瓶中的胶体上下震荡,使的完全悬浮,但勿产生太多气泡。 3. 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时,可于顶端添加胶体,以达所要高度;胶体高度约90 cm。 4. 胶体完全沈降后,小心以buffer A-150 加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度,使流速约每五~六秒一滴,并设定收集体积为2.5 mL/tube。 5. 胶柱流洗约100 mL 后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高,注意勿破坏胶体表面平整; 然后打开出口,使液面下降至胶体面,再关闭出口,准备注入样本。 四、样本色析进行 1. 以微量移液器或滴管吸取样本 (样本体积不得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿破坏胶体的平整表面!(样本确实体积 _______ mL) 2. 打开出口,同时开启部分收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次。不得扰动胶体表面,造成凹陷。 3. 暂时关闭出口,将液面高度加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高度,使流速为6 s 一滴。 4. 要留心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜,收集约80 管。 10) 收集试管,进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定,并请作图。 5. 收集GUS 活性区,以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后,加buffer A-0 稀释至20 mL,再次浓缩至 _______ mL (GF),保留100 uL。 6. 管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后,小心放置一旁,准备以后进行分子量测定。 五、分子量测定 1. 进行分子量测定前一天,请先以buffer A-150 流洗100 mL,并检查胶柱内有无气泡产生,若有严重的气泡或干裂,必须重新装填管柱。 2. 取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL (以亲和层析法所得的AF 部份),如上法注入管柱中,立刻开始进行胶体过滤,并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。 3. 收集所得,进行蛋白质定量分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为分子量依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitamin B12的溶离管数。利用以上数据,可画出分子量与溶离管数间的直线关系,作为分子量判定的标准校正线。 4. 同样的一批分划,请进行酶活性分析 (GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的分子量。 六、拆除管柱及保存胶体 1. 若管柱长期不用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧,有时可能不易取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。 2. 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再度使用时,请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒,若有结块而不易打散者,也不要使用。
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