蛋白质的纯化

实验概要

本实验介绍了用蛋白纯化试剂盒(HisTrap HP Kit)进行蛋白质纯化的过程。

主要试剂

高分子量蛋白Marker购自上海华舜生物工程有限公司

蛋白纯化所用的试剂盒(HisTrap HP Kit)购自Amersham Biosciences ( USA)公司

0.45 pm滤膜，磷酸缓冲液，咪唑，NaCl，EDTA，NaOH，NiSO₄，0.025%考马斯亮兰R-250

主要设备

注射器，高速离心机，变性聚丙烯酞胺蛋白凝胶电泳装置

实验步骤

纯化的过程是在室温25℃的条件下进行的。纯化之前，按照HisTrap HP Kit说明书制备蛋白样品，然后用0.45 pm滤膜过滤，去除一些细胞碎片或其它杂质，以免阻塞镍柱，纯化时使用注射器上样。

1. 镍柱的准备

在第一次使用镍柱时，先用5 ml蒸馏水过柱，如有空气存在，应反复用水冲洗，直至空气消除；然后用5 ml binding buffer (1 x磷酸缓冲液，20 mM咪唑，pH 7.4)过柱和5 ml elution buffer(1 x磷酸缓冲液，40 mM咪唑)过柱，最后用10 ml binding buffer过柱。

2. 样品过柱

用注射器吸取10 ml binding buffer过柱，平衡柱子(lx的磷酸buffer，20mM咪唑，pH7.4 )；上样(含his-tags的融合蛋白样品)，收集蛋白flow-through fraction；10 mlbinding buffer过柱，收集wash fraction；5 ml elution buffer (1 x磷酸缓冲液，40 mM咪唑)过柱，收集洗脱液，每毫升收集一管；依次使用更高咪哩浓度的缓冲液洗柱，并分别收集相应的洗脱液。

3. 镍柱再生

10 ml binding buffer (1 x磷酸缓冲液，20 mM咪唑，pH 7.4)过柱后镍柱即可再次使用，但为防止蛋白的交叉污染，每根柱子最好只用于同种蛋白的纯化。如果用于不同蛋白的纯化，必需进行柱子的清洗，并重新填充镍离子。在重新填柱或储存之前，要将柱子中的镍离子去除，用10 ml包含有20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl，0.05 M EDTA，pH7.4的buffer清洗柱子，为了去除沉淀的蛋白，先去除镍离子后，用1M的NaOH充满柱子，然后将柱子浸泡在NaOH中2h，用10 ml蒸馏水和pH7.0的buffer洗出溶解的蛋白，直至流出液的pH约达到7.0。再用10 ml蒸馏水清洗一次，然后用0.5 ml 0.1 M NiSO₄(用蒸馏水配制)填充柱子。最后，再先后用5 ml蒸馏水和5 ml binding buffer过一次柱子。现在的柱子就可以重新使用了。

4. 最佳洗脱浓度确定

收集的样品变性聚丙烯酞胺蛋白凝胶电泳((SDS-PAGE)观察，根据观察结果，确定融合蛋白的最佳洗脱缓冲液浓度，融合蛋白一般集中出现洗脱液的第二和第三管中。

5. His-tags融合蛋白的纯化

准备相应缓冲液(参见附录)，控制pH值在7.4-7.6；根据镍柱准备的步骤进行洗柱；10 ml binding buffer(lx磷酸缓冲液，20 mM咪唑，pH 7.4)过柱；上样，收集flow-through fraction；分别用5 ml elution buffer(1 x磷酸缓冲液，20，40，60，300，500 mM咪唑)过柱，收集洗脱液，每毫升收集一管。

6. 融合蛋白的SDS-PAGE电泳

取样品液10ul与等体积的2xSDS加样缓冲液混合；沉淀用适当体积的1xSDS加样缓冲液悬浮；100℃沸水浴5 min，冷却后点样进行15% SDS-PAGE电泳(15%分离胶，5%浓缩胶)，电泳结束，0.025%考马斯亮兰R-250染色。