蛋白质组学实验技术大全

每一个领域的发展都是基于技术的进步和革新，蛋白质组学亦然。蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。在开始实验之前，先看看这篇技术简介吧。

一 蛋白质与DNA相互作用

在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。随着重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性的。为此需要：1. 鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；2. 分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子。这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。研究DNA-蛋白质相互作用主要包括以下实验方法：

1 凝胶迁移实验（EMSA）

EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。

在此基础上又延伸出了DNA竞争实验（DNA competitive assay），具体做法是：在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。

应用

（1）鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；

（2）DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；

（3）通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；

（3）也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。

2 DNaseI足迹实验

足迹实验（foot-printing assay），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法。蛋白质结合在DNA特定片段上，能保护该部位不被DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。足迹试验特异性好，定位精确，使用广泛。

3 甲基化干扰实验

甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化，对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。

除了DNaseI 足迹试验之外，目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验，例如：a. 自由羟基足迹实验；b. 菲咯啉铜足迹实验；c. DMS（硫酸二甲酯）足迹实验。

应用

（1）甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系。

（2）是足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。

4 体内足迹实验

上面介绍的三种研究蛋白质与DNA相互作用的方法，有一个共同的不足之处：在体外进行实验，可想而知，这些实验结果未必能反映细胞内发生的真实生命过程，即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况。

为了解决这个问题，科学家就设计出了一种体内足迹试验（invivo foot-printing assay），该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种。

体内足迹试验的原理原则同体外DMS足迹实验无本质差别，即:

（1）DMS能够使G残基甲基化。

（2）六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基。

（3）同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化，于是不会被六氢吡啶切割。

（4）同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较，就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带。

二 蛋白质与蛋白质相互作用

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，对调控细胞及其信号有重要意义。研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。检测蛋白质间相互作用的实验方法有很多，究竟有哪些呢？小编总结了一个表格。