蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定（2）

二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化

1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。

2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。

3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。

4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。

5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。

第二部分 蛋白质的鉴定

目的要求

（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。

（2）掌握凝胶电泳实验操作规程。

实验原理

电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。但如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。十二烷基硫酸钠（SDS）就具有这种作用。在蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原，蛋白质—SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳漕缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括积层胶和分离胶两部分。当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率，使蛋白依各自的大小得到分离。

试剂和器材

一、试剂

[1] 30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

[2] 1.5mol/L Tris(pH8.8)

[3] 10% (w/v) SDS

[4] 10% 过硫酸铵：4℃保存。

[5] TEMED

[6] 3×SDS凝胶加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH6.8), 300mmol/L DTT, 6% SDS, 0.6%溴酚蓝，30% 甘油
[7] 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱，94g甘氨酸（电泳级），50mL 10% SDS, 配至1000mL.

[8] 考马斯亮蓝染液：0.25g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇：水（1：1）和10mL冰乙酸的混合液中。

[9] 脱色液：水：乙酸：乙醇 = 6.7：0.8：2.5

二、器材

DYCZ-24D型垂直板电泳槽, 移液管（1，5，10mL），烧杯（25，50，100mL），细长头的吸管，微量注射器（10μL或者50μL）。

操作方法

一、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配置：

1. 安装玻璃板，检查漏液情况。

2. 制备分离胶：按表1分离胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入TEMED后，凝胶马上开始聚合，故应立即快速悬动混合物，迅速在两玻板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，注意流出积层胶所需空间。并在其上覆盖一层水或异丁醇溶液。将凝胶垂直放置于室温下。

分离胶聚合后（约30min），倒出覆盖层液体，用枪将残留液体吸净。
制备浓缩胶：按表1积层胶所示，依次在试管中混合各成分，一旦加入TEMED后，

应立即快速悬动混合物，迅速在分离胶上灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的电泳梳，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下。

 二、上样样品的处理：

将样品置于1×SDS 凝胶加样缓冲液中，在100℃加热5min使蛋白质变性。加热后3000rpm离心1min.

三、 电泳：

1. 浓缩胶聚合完全后（约30min），将凝胶固定于电泳装置上，并加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，然后小心移出电泳梳。

2. 按预定顺序加样，小心缓慢加入样品，每样品加12ul。

3. 将电泳与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约4h），然后关闭电源。

4. 将玻璃板从电泳装置上卸下，并将凝胶取出，在第一点样孔侧的凝胶上切去一角以标注凝胶的方位。

四、 考马斯亮蓝染色

1. 用染液浸泡凝胶，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上染色15min, 重复加热染色1 次。

2. 移出并回收染液，将凝胶浸泡于脱色液中，用保鲜膜封好，略微加热，放在水平摇床上脱色30min,更换脱色液，直至检出蛋白质条带。

3. 拍照并分析蛋白质的诱导，表达，分离纯化情况。